题目：超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞学研究

通过对小鼠腹水型Sl80、在体Sl8O肉瘤细胞、艾氏腹水瘤细胞和离 体培养的人结肠癌细胞(SW一480)、黑色素瘤细胞(LiBr)等的研究，筛选出不同细 胞对超声激活血卟啉杀伤的敏感阈值，并从处理后不同肿瘤细胞在显微结构、超 微结构、细胞化学、分子结构等方面的变化对超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子 生物学机理进行了初步的分析。研究中发现在一定实验条件下确实存在国外学者 提出的单线态氧等自山基对肿瘤细胞的杀伤作用，但不是SDT(Sonodvnamic therapy)抑癌作用的唯一机制。SDT抗肿瘤机制存在多种模式，且受不同理化因 子和复杂的生物学因素交互影向。尤其是实验中首次发现的低强度超声激活血卟 啉能诱导四种肿瘤细胞凋亡的现象，表明在SDT抗肿瘤机制中存在着促细胞死亡 和诱导细胞凋亡两种模式。这一研究成果对于丰富和发展SDT理论，深入SDT抗 癌机制研究具有一定的科学意义。本论文所阐述的结论主要有下述方面： 1．SDT抗在体Sl8O腹水型癌细胞和实体瘤细胞研究 ①通过超声激活血卟啉对S18O肉瘤生长状况的研究筛选出了作用于Sl80实 体瘤有效的最低超声强度及处理时间。本实验发现血卟啉对肿瘤的抑制作用甚微， 对肿瘤体积的抑制率为3.19％，对重量的抑制率为0.39％；当超声强度为O.6W／cmˉ2， 超声对肿瘤体积及重量的生长抑制率分别为57.07％和39.9％，而同样的超声强度 结合血卟啉对肿瘤体积及重量的生长抑制率分别增加至87.15％和78.8％。荷瘤小 鼠实验表明：血卟啉对肿瘤组织生长的抑制作用甚微，单纯超声有一定的抑制肿 瘤生长效应，而超声激活血卟啉能够有效的抑制肿瘤组织的生长。 ②利用光镜及透射电镜技术观察处理后肉瘤组织细胞形态结构的变化。研究 结果表明，血卟啉对肿瘤细胞影响较小，单纯超声和超声激活血卟啉均具有破坏 细胞结构的作用，其破坏作用表现在生物膜系统和遗传信息表达系统受损，线粒 体是SDT杀伤肿瘤细胞的敏感细胞器。 ③利用酶组织化学技术检测超声激活血卟啉对细胞色素C氧化酶活性的影 响。发现血卟啉对肿瘤组织细胞色素C氧化酶的活性影响较小，超声对酶活性有 一定程度的影响，而超声激活血卟啉使细胞色素C氧化酶的活性大幅度降低。酶 活性的降低在处理后lh就已表现出来，在处理后3h、6h酶活性持续降低，这一 动态变化表明细胞能量合成功能持续下降是细胞继发性损伤的重要原因之一。 ④首次利用扫描电镜技术观察同一频率，不同强度的超声处理后腹水型S18O 肿瘤细胞表面结构的变化。结果表明血卟啉对细胞有一定的影响，主要表现为微 绒毛的减少；不同超声强度对细胞形态和表面结构亦有轻度的损伤，但在同等强 度和处理时间条件下，超声激活血卟啉对肿瘤细胞的损伤最大，大部分细胞破损 为碎片或带有泡状突起的细胞残片。 ⑤首次在SDT抗在体S18O腹水型癌细胞和肉瘤细胞研究中，发现超声激活 血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡现象。 SDT抗在体Sl8O腹水型癌细胞和肉瘤细胞研究相对于离体培养细胞的简单实 验系统，是一个受体内多因素影响的复杂实验系统。由于肉瘤组织的异质性，细 胞间相互影响、细胞内血卟啉富集和代谢、细胞所处的微环境等特殊性，所以导 致肉瘤组织细胞受超声激活血卟啉处理后的细胞形态学变化和细胞凋亡特征与离 体培养的游离细胞有一定的差异。而且在杀伤细胞的超声强度、频率、辐照时间 等参数阈值方面也有所不同。 首次从受损细胞的生物膜结构、细胞骨架系统和遗传信息表达系统变化探讨 SDT抗肿瘤的细胞分子生物学机制，阐明显微、超微结构和分子结构变化对细胞生 理功能的影响，研究中发现线粒体超微结构及其内膜标记酶活性状态是SDT抗癌 作用的敏感位点，是导致肿瘤细胞原发性损伤、继发性损伤直至死亡的直接原因 和间接原因。细胞是一个高度有序的结构体系和自控系统，线粒体作为细胞生命 活动能源的主要提供者，其结构与功能的破坏必然形成细胞代谢“能障”，使细胞 内生物合成受阻、信号传导和生理调节失控，细胞结构稳定性破坏，最终导致细 胞死亡。 2．SDT抗艾氏腹水瘤细胞研究 ①首次采用不同超声强度对体内生长的艾氏腹水瘤细胞进行体外处理，筛选 出SDT抗艾氏腹水瘤体外实验条件。发现在频率2.0MHz，强度1.0W／cmˉ2、l.5W／cmˉ2、 2.OW／cmˉ2时超声激活血卟啉对艾氏腹水瘤的杀伤作用规律。 ②阐明了不同强度下，艾氏腹水瘤生物膜系统、遗传信息表达系统显微结构 和超微结构受损的特征及程度，分析了细胞受损的敏感部位，并对SDT的抗癌作 用进行了初步的细胞学研究。 ③通过形态学研究和荧光双染检测，首次发现超声激活血卟啉可诱导艾氏腹 水瘤细胞凋亡现象，讨论了不同强度处理下细胞凋亡和直接损伤造成的细胞坏死 的相对数量及转化。提出SDT诱导细胞凋亡是抗肿瘤效应的重要途径之一。 对体内生长的EAC细胞，用不同强度的超声进行离体处理，这样可以有效地 排除超声热效应和体内众多因素的影响，从而突出超声激活血卟啉对EAC细胞杀 伤作用的直接性和针对性。研究结果表明：单纯超声作用在不同强度下可影响细 胞的结构与功能，在声强2.0 W／cmˉ2时对部分细胞的杀伤作用明显，其作用机理与 超声产生的空化作用相关；与单纯超声处理相比，低于2.0 W／cmˉ2强度的超声激活 血卟啉由于其协同作用对EAC细胞有显著的杀伤作用，这对于SDT法应用于临床 治疗选用较低强度超声激活血卟啉进行抗癌治疗，并减少对正常组织细胞的影响 具有重要的意义。研究中首次发现的低强度超声激活血卟啉能诱导EAC细胞凋亡 现象可进一步说明SDT法是在低强度超声处理时杀伤癌细胞的机制之一，随着超 声强度的增加，在继续诱导细胞凋亡的同时亦可直接造成部分细胞的病理性坏死， 由此表明超声激活血卟啉抗癌存在着诱导细胞凋亡和直接坏死两种模式。 3．SDT抗人结肠癌细胞(SW一48O)研究 ①首次利用光镜H－E染色、PI－H033342双重荧光染色、扫描电镜技术观察 超声处理后SW－48O肿瘤细胞形态结构的变化，证实声动力学疗法通过破坏肿瘤 细胞显微、超微结构，尤其是肿瘤细胞膜和膜性细胞器的通透性和结构，导致肿 瘤细胞死亡和凋亡，从而达到抗肿瘤效应。 ②首次通过TBA显色法检测了不同频率超声结合血卟啉对肿瘤细胞脂质过 氧化程度的影响，发现过氧化脂质量增高，在形态上表现为细胞膜破损、出现空 洞，造成细胞膜结构破坏、流动性下降、通透性增高，引起细胞凋亡或直接杀死 肿瘤细胞。 ③首次通过克隆形成试验反映肿瘤细胞增殖潜力情况的变化，研究中检测到 生理盐水、RPMIl640培养基及完全培养基三种悬浮液中的肿瘤细胞经超声结合血 卟啉处理后的相对克隆形成率分别为l6.9％、9.0％和l4.4％，表明被声照的肿瘤细 胞的增殖潜力大大降低。 ④首次观察到超声激活血卟啉诱导SW－480细胞凋亡现象，PI－H033342双重 荧光染色结果显示了超声处理后细胞死亡的同时伴有明显的细胞凋亡现象。进一 步说明了声动力学疗法杀伤肿瘤细胞的过程中有促使细胞死亡和凋亡两种作用模 式并存，在一定的条件下，凋亡细胞最终转变为死亡细胞。 4．SDT抗黑色素瘤细胞(LiBr)研究 ①首次利用MTT法对频率为1.1MHz时，超声激活血卟啉杀伤离体人LiBr 肿瘤细胞的最佳超声强度、作用时间等参数的筛选，证实了肿瘤细胞对不同频率 超声，不同超声强度以及不同处理时间的反应不同。 ②发现在频率为1.1MHz超声下，LiBr细胞在输出能量为0.6W／cmˉ2、处理时 间l80s下，4h后可达到7l％的死亡率；强度为0.8W／cmˉ2、处理时间60和90s后， 经6h，首次对LiBr细胞系检测到明显的细胞凋亡现象。 ③首次从琥珀酸脱氢酶的活性研究、显微水平细胞形态结构的变化、细胞膜 透性的变化、超微水平细胞形态结构的变化和DNA分子结构的变化，证实SDT法 可以通过影响酶活性、改变细胞膜透性；损伤细胞显微、亚显微和超微形态与结 构；损伤DNA分子的结构来产生抗肿瘤效应。 ④首次提出声动力学疗法杀伤LiBr肿瘤细胞存在促细胞死亡和促细胞凋亡 两种模式，在一定的超声处理强度和处理时间下，其中一种模式占主导，但并不 排除另一种模式的作用。 SDT杀伤离体培养肿瘤细胞的研究表明：声照细胞表面突起减少、贴壁性下陷 和膜通透性增大是癌细胞受损的早期形态学特征，而细胞形态变圆、胞体膨大、 细胞核固缩、细胞膜破损、胞质丢失直至细胞解体是细胞受损的继发性损伤，其 程度随处理时间延长而加剧。实验中发现的癌细胞荧光染色特征及细胞核皱缩， 染色质深染、凝聚成新月状附在核膜周边，胞膜出芽、脱落形成凋亡小体，核 体间DNA链断裂等特征说明SDT抗肿瘤机制中存在细胞凋亡模式。 通过离体培养细胞简单实验系统首先筛选出能够有效杀伤不同离体培养肿 细胞的超声频率、强度、辐照时间和血卟啉浓度，然后根据离体培养细胞和在 肿瘤组织细胞的差异性，进一步确定适用于SDT抗在体肿瘤的相关实验参数组从而为SDT用于不同的荷瘤实验动物模型抗癌研究和最终用于临床治疗人类肿瘤提供实验依据。