● 摘要
茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)为被子植物门，双子叶植物纲，杜鹃花目，山茶科，山茶属的多年生木本常绿植物。起源于中国，原产于我国四川、云南、贵州等地和印度阿萨姆一带，是我国重要的叶用经济林木之一。茶树从花芽形成到种子的成熟大约需要一年半的时间，在这期间茶树的营养生长和生殖生长同时进行，也会同时吸收机体的营养物质，因此茶树旺盛的生殖生长必定会抑制营养生长，从而影响茶树芽叶的产量和品质，降低经济效益。因此，抑制茶树的生殖生长，促进营养生长，提高茶树芽叶的产量和质量，对提高茶产业经济效益和社会效益具有重要理论和实践意义。
陕西茶区地处秦巴山区，地理位置独特，生态条件优异，终年气候温暖湿润，雨量充足，年平均气温适宜，在长期繁衍和进化过程中产生了独特的生物学特性和遗传多样性丰富的茶树种质资源。1981-1984年陕西省进行了茶树种质资源品种的调查，将陕西茶树种质资源分为紫阳群体、西乡大河坝群体、南郑碑坝群体、白河歌风群体、宁强广坪群体、苦茶群体、山阳漫山群体在内的7大群体28个品种，还有部分稀有品种，如紫阳1号、城固县高北村梨树坪的大茶树等。这些类型丰富的茶树资源，为开展茶树花发育的研究提供了有利的条件。
以往对茶树的研究多集中于茶树生化成分、适制性、抗逆性等方面，也有学者在茶树花形态结构及花发育过程等方面做了解剖学研究，但对茶树生殖生长相关基因的研究报道较为少见，目前也未克隆到与茶树花发育直接相关的基因。为了能更深入地对茶树花发育的分子机制进行研究，抑制茶树生殖生长，促进营养生长，提高茶树芽叶的质量和产量提供理论和现实依据，因此，有必要对茶树花发育过程中特异表达的基因进行克隆研究。
本论文以陕西紫阳群体种的代表性种质紫阳槠叶种为材料，采用改良的SDS-酸酚法提取茶树芽叶和花器官总RNA，进一步通过mRNA差异显示技术分析了茶树花发育过程中基因的差异表达，利用生物信息学检索对差异表达基因的功能加以确定，并结合半定量RT-PCR对差异表达基因进行了表达特性的研究。本研究获得的主要结果如下：
1. 采用改良SDS-酸酚法分别提取茶树鲜叶、冻叶和干叶的总RNA，在研磨时加入了不溶性的PVPP；在提取缓冲液中加入了PVP和β-巯基乙醇；在匀浆缓冲液中未用水饱和酚进行抽提，而是加入了pH为4.8的 NaAc。用以上改良步骤来防止多酚类物质和多糖类物质对总RNA提取的阻碍，有效降低了总RNA的损失。结果表明，改良的SDS-酸酚法不但能从茶树鲜叶也能够从冻叶和干叶中提取到纯度好、质量高的总RNA。28S rRNA亮度约为18S rRNA的2倍，A260/A280在1.8-2.0之间，可用于本研究中茶树芽叶和花芽发育不同阶段的总RNA提取及进一步的分子生物学分析。
2. 采用mRNA差异显示技术研究陕西地方茶树的代表性种质紫阳槠叶种在芽叶和花芽分化发育过程中的6个不同阶段，克隆与花发育相关基因的差异表达cDNA。共获得了差异表达片段27个，其中在花芽形成和发育过程中表达量增加的片段共12条，表达量降低的片段共15条，说明在茶树花芽形成和发育过程中确实存在大量相关基因的差异表达。
3. 经二次PCR扩增和RT-PCR分析，最终获得了与茶树花发育相关的差异表达cDNA片段3个，分别是：DF-1(B0328/ B0304)、DF-4(B0329/ B0303)和DF-14(B0329/ B0306)。测序结果显示长度分别为：321bp，329bp和242bp。
4. 测序结果经Blast-X同源性比对和半定量RT-PCR分析表明，DF-1与多种植物的精氨酸酶基因有高度同源性，推测可能是茶树精氨酸酶基因的cDNA片段，命名为Csaf。在芽叶和花芽分化发育过程中，Csaf为下调表达片段；DF-4和DF-14未检测出同源序列，所以推测可能是未知基因，分别命名为Csfdf 1和Csfdf 2，其编码的蛋白质可能与茶树花发育有关，但具体功能未知。