● 摘要
恶性肿瘤是当前威胁人类健康的主要疾病之一，根据世界卫生组织公布的资料表明，全球每1O个死亡者，其中就有1人死于癌症。目前，治疗肿瘤的方法有很多种，包括放疗、化疗以及外科手术疗法等。而关于超声在肿瘤治疗中的应用就涉及到高强度聚焦超声疗法、超声热疗法和超声声动力学疗法。 声动力学疗法是由日本学者UmemuraS．于上世纪8O年代末提出的一种以超声结合血卟啉的联合作用杀伤肿瘤细胞的新方法，该疗法是利用超声具有穿透深部组织并能聚焦于肿瘤部位，激活相对无毒性且能长时间富集在肿瘤组织的血卟啉，从而对肿瘤产生杀伤作用的。由于该方法对于治疗肿瘤细胞有较强的针对性以及对正常组织的无创伤性，所以对于治疗肿瘤，特别是组织深层肿瘤有着较好的应用前景。近些年来，国内外学者对声动力疗法杀伤肿瘤的作用机理开展了多学科的研究工作，并取得了一定的成果，但对于其确切作用机制尚不能定论。 本论文在前人研究结果之上，以国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制”为依托，完成了其中的一部分工作，目前取得的实验结果如下： 1．测得实验所用血卟啉的最大荧光激发波长为402nm，最大荧光发射波长为596nm，在此基础之上，通过荧光分光光度法测得加入血卟啉后45min时S180肿瘤细胞内HpD含量最高，此为最佳的超声处理时间；而对于肿瘤组织而言，杀伤肿瘤的最佳处理时间点应选择在24h-72h之间。 2．通过不同强度超声对Sl80肿瘤细胞的杀伤作用研究得出：不同超声强度下，细胞的存活率有所不同；不论是单纯超声组还是超声结合血卟啉组，细胞存活率都随超声强度的增加而下降。通过不同超声处理时间对S180肿瘤细胞的杀伤作用研究得出：不同超声处理时间下，细胞的存活率有所不同；不论是单纯超声组还是超声结合血卟啉组，细胞存活率都随超声处理时间的增加而下降。 3．通过光镜、扫描电镜和透射电镜技术观察了频率为2.2MHz、强度为4W/cmˉ2的聚焦超声结合血卟啉处理后S18O肿瘤细胞显微以及超微结构变化，结果表明：单纯超声对S180肿瘤细胞有一定的杀伤效应，而超声结合血卟啉所产生的协同效应对S180肿瘤细胞的杀伤作用明显高于单纯超声组；超声结合血卟啉可以破坏肿瘤细胞的显微以及超微结构，尤其是对肿瘤细胞膜和膜性细胞器的通透性和结构的损伤，且在杀伤肿瘤细胞的同时存在诱导肿瘤细胞凋亡的现象。细胞显微、超微结构以及AnnexinV-PI研究的结果表明：在超声结合血卟啉杀伤S18O肿瘤细胞机制中，可能存在诱导细胞凋亡的途径和直接破坏细胞超微结构两种模式。 4．通过免疫细胞化学方法检测了处理后凋亡相关基因bcl.2和caspase3在细胞中表达的变化，对照组、单纯血卟啉组以及单纯超声组中的Bcl-2蛋白含量变化不大，超声结合血卟啉组中Bcl-2蛋白含量与其他三组相比有所降低，经差异显著性分析，其P值小于O.05。而Caspase-3在对照组和单纯血卟啉组表达量基本接近，而在单纯超声组及超声结合血卟啉组中其蛋白含量增加。 5．通过FBA显色法检测了超声结合血卟啉处理对S180肿瘤细胞脂质过氧化程度的影响，实验结果显示，超声结合血卟啉处理后细胞的脂质过氧化含量高于对照组、单纯超声组和单纯血卟啉组。 6．通过研究自由基清除剂组氨酸、甘露醇和SOD在超声结合血卟啉杀伤肿瘤细胞中的作用得出：超声结合血卟啉对S180肿瘤细胞的杀伤作用可以被组氨酸和甘露醇所抑制，而不被SOD抑制，推测超声结合血卟啉杀伤肿瘤细胞的机制可能是超声结合血卟啉产生羟基自由基所引起的。 7．通过研究不同强度超声对小鼠S180实体瘤的杀伤作用得出：超声强度5W/cmˉ2是杀伤S18O肿瘤的一个阈值，在此条件下，超声处理对小鼠S180实体瘤有一定的抑制作用。 8．研究了聚焦超声结合血卟啉对S18O实体瘤的肿瘤体积、重量的抑制作用得出：超声结合血卟啉对肿瘤体积的抑制作用为单纯超声的2倍；单纯超声及超声结合血卟啉对小鼠重量也都有明显的抑制作用，其分别为20.67％和33.09％。 9．通过光镜和透射电镜技术观察了频率为2.2MHz、强度为5W/cmˉ2的聚焦超声结合血卟啉处理后S18O肿瘤细胞显微以及超微结构变化，结果表明：单纯超声对在体S18O肿瘤细胞有一定的杀伤作用，且随着取材时间的延长，损伤进一步加大；同等条件下，超声结合血卟啉所产生的协同作用对S180肿瘤细胞的损伤明显大于单纯超声。 本论文在前人研究的基础上，测定了血卟啉的荧光光谱及其在腹水型S180肿瘤细胞和肉瘤S18O肿瘤组织的富集分布，为超声结合血卟啉杀伤肿瘤细胞提供了前提基础。利用不同超声强度以及不同超声处理时间对S180肿瘤细胞的杀伤作用研究确定合适的处理条件。通过光镜、电镜以及AV-PI法研究了处理后细胞的形态结构的变化；通过免疫细胞化学方法研究了处理后Bcl-2和Caspase-3含量的变化；通过脂质过氧化和自由基清楚剂组氨酸、甘露醇和SOD的使用，对超声结合血卟啉杀伤肿瘤细胞的机制进行了探讨。总结本论文的实验结果提出，超声结合血卟啉杀伤肿瘤细胞的机制存在多种模式，且受不同理化因子和生物个体的复杂性的影响。 同时，通过对S180实体瘤的肿瘤体积、重量的抑制作用和形态学变化进行了研究，与腹水型肿瘤细胞相比，超声结合血卟啉在杀伤S18O实体瘤过程中所引起肿瘤细胞凋亡现象较少，这可能是由于腹水型细胞和实体瘤组织在结构及其生长环境的差异以及对超声的敏感性不同所引起的。总之，超声结合血卟啉杀伤肿瘤的机制还有待于进一步深入研究。 以上研究成果为声动力学疗法治疗肿瘤的机理研究提供重要的资料，对丰富和进一步发展该理论有重要意义，同时也为该疗法的早日临床应用积累了资料。