题目：纳米粒子组装电化学生物传感器和电化学发光免疫分析法的研究

　　生命科学、材料科学、环境科学的发展，对分析化学提出了越来越 高的要求，同时也极大地促进了分析化学的发展。传统的分析方法往往需要烦琐 费时的分离、复杂昂贵的仪器设备，分析速度慢、耗时长，且劳动强度大。建立 高灵敏度、高选择性、简单、快速的分析方法和廉价的小型化分析装置是分析化 学工作者的研究目标。我们长期的研究目的是建立快速、灵敏、可实现自动化的 新型均相电化学发光免疫分析方法，研制具有实用价值的纳米组装电化学和电化 学发光生物传感器，为临床免疫检测和基因检测提供性能优良的分析器件。 　　本论文研究工作旨在研究纳米粒子组装电极上电化学检测信号的增强作用， 结合生物分子识别物质如酶、抗原/抗体和DNA的特异性，研制具有实用价值的 纳米组装电化学生物传感器；利用多标记技术和磁性微粒的容易分离作用，结合 生物分子识别物质一抗原/抗体的特异性，建立简单、快速、灵敏的电化学发光免 疫分析新方法。本论文研究工作是在国家自然科学基金“新型功能纳米材料组装 电化学发光生物亲合传感器的研究”(N0.20375025)和“新型均相电化学发光免 疫法的研究”(N0.29975017)项目的资助下完成的。本论文研制了五种高灵敏 度、高选择性、简单的碳纳米管组装电化学生物传感器；建立了两种简单、快速、 灵敏的电化学发光免疫分析方法，并将其成功地用于过氧化氢、葡萄糖、酚类物 质、IgG抗体、地高辛、碱基、DNA序列等物质的测定；还初步研究了DNA与 电活性药物维生素B_6和氧氟沙星的相互作用，探讨了相互作用机理。 　　第一章　引言详细介绍了电化学生物传感器和有关电化学分析的基本原理 及电化学生物传感器的固定化技术，概述了电化学发光分析法的基本原理，着重 评述了电化学生物传感器和电化学发光分析法的研究进展，还简要地介绍了超声 电化学的基本原理和研究进展。 　　第二章　碳纳米管组装电化学生物催化传感器的研究研制了碳纳米管组 装基于血红蛋白直接电子转移的第三代过氧化氢生物传感器和碳纳米管组装预氧 化电流型葡萄糖生物传感器，并将其用于实际样品眼药水中过氧化氢和血清中葡 萄糖的测定。 　　第三章　电化学免疫传感器的研究研究了碳纳米管组装电极上酚类物质 的电化学行为，建立了同时测定对苯二酚和邻苯二酚异构体的电化学分析新方法； 研制了碳纳米管组装电化学免疫传感器，建立了免疫竞争法检测IgG抗体的高 灵敏度电化学分析新方法。 　　第四章　电化学发光免疫分析法的研究利用多标记技术和磁性微粒容易 分离的作用，提出并建立了多标记均相电化学发光免疫分析方法，并将其用于模 拟血清样品中地高辛含量的测定；以合成的钌联吡啶为电化学发光标记物，建立 了测定地高辛灵敏、快速的磁性微粒电化学发光免疫分析法。 　　第五章　电化学DNA生物传感器的研究研制了碳纳米管糊电极，研究 了碳纳米管糊电极上碱基的电化学行为，建立了同时测定多个碱基的高灵敏度、 高选择性电化学分析新方法；研制了高灵敏度、高选择性的电化学DNA传感器， 建立了互补DNA序列测定的分析方法；还研究了电活性药物与DNA的相互作 用。 　　本论文具体研究内容简述如下： 　　1.碳纳米管组装第三代过氧化氢生物传感器设计了一种基于血红蛋白直 接电子转移的碳纳米管组装第三代过氧化氢生物传感器。在碳纳米管组装电极上， 吸附的血红蛋白可实现直接电子转移，氧气存在下对过氧化氢的还原具有良好的 催化活性，且随过氧化氢浓度的增大，催化电流随之增大。基此研制了碳纳米管 组装第三代过氧化氢生物传感器。在0.20m0l/LpH5.4醋酸缓冲溶液中，工作电 位为-0.30V(vs.Ag/AgCl，3m0l/LNaCl)时，传感器的响应电流与过氧化氢的浓 度在6.0×10ˉ(-6)m0l/L～2.0×10—(-4)m0l/L之间呈良好的线性关系，相关系数为0.9966。 检出限为1.2×10ˉ(-6)m0l/L。对8.0×10ˉ(-6)m0l/L过氧化氢进行11次平行测定，相对标 准偏差为2.4％。将该法用于眼药水中过氧化氢的测定，结果满意。 　　2.碳纳米管组装预氧化电流型葡萄糖生物传感器设计了一种基于固定电 子介体、酶、预氧化物质、碳纳米管为一体的碳纳米管组装预氧化电流型葡萄糖 生物传感器。碳纳米管糊电极本身具有良好的导电性，碳纳米管糊中添加二氧化 铅，可消除抗坏血酸、尿酸等还原性物质对葡萄糖测定的干扰。该传感器具有良 好的灵敏度和消除干扰的能力(1.8mm0l/L抗坏血酸，2.2mm0l/L尿酸不干扰 1.0mm0l/L葡萄糖的测定)，在＋0.40V(vs.SCE)的工作电位下仍保持较高的选 择性和较短的响应时间(10s)。该传感器的响应电流与葡萄糖浓度在0.5～20 mm01/L范围内呈线性关系，相关系数为0.9987。该传感器应用于人血清中葡萄 糖含量的测定，结果满意。 　　3.碳纳米管组装电极上酚类物质的电化学行为及其分析应用的研究研究 了碳纳米管组装电极上对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚的电化学行为。碳纳米管 组装电极上，邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚的氧化峰明显分开。基此建立了同 时检测邻苯二酚和对苯二酚的电化学分析新方法。在选定的实验条件下，在 1.0×10ˉ(-4)m0l/L邻苯二酚存在的条件下，响应电流与对苯二酚浓度在1.0×10ˉ(-6) m0l/L～1.0×10ˉ(-4)m0l/L之间呈良好的线性关系，相关系数为0.9959。检出限为 7.5×10ˉ(-7)m0l/L。在1.0×10ˉ(-4)m0l/L对苯二酚存在的条件下，响应电流与邻苯二酚 浓度在6.0×10ˉ(-7)m0l/L～1.0×10ˉ(-4)m0l/L之间呈良好的线性关系，相关系数为 0.9963。检出限为2.0×10ˉ(-7)m0l/L。将所建立的方法应用于模拟样品中对苯二酚和 邻苯二酚的同时测定，结果满意。 　　4.碳纳米管组装电化学免疫传感器的研究以IgG，抗体为分析物，以对苯 二酚为底物，以辣根过氧化物酶为标记物，以对苯二酚.过氧化氢.辣根过氧化物 酶为检测体系，研制了碳纳米管组装电化学免疫传感器，建立了免疫竞争法检测 IgG抗体的高灵敏度电化学分析新方法。工作电位为＋0.030V(vs。SCE)时，响应 电流与IgG抗体浓度在0.30～l0gg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为 0.9923。检出限为0.11μg/mL。将该传感器用于模拟血清样品中抗体含量的检测， 结果满意。 　　5.多标记均相电化学发光免疫分析法以BSA为载体蛋白，将地高辛和电 化学发光标记物鲁米诺均标记在BSA上，首次提出并建立了多标记均相电化学发 光免疫分析方法。根据免疫反应前后结合物分子扩散系数的变化，引起电化学发 光强度的变化，建立了均相电化学发光免疫分析法测定地高辛抗体和竞争法测定 地高辛的分析方法。电化学发光信号与地高辛抗体稀释度在1/50000～l/2000倍 间呈一定的关系，电化学发光信号与待测地高辛浓度在0.50ng/mL～30ng/mL间 呈良好的线性关系，相关系数为0.9976。地高辛检出限为2.8×10ˉ(-10)g/mL。对1.0 ×10ˉ(-9)g/mL的地高辛进行11次测定，相对标准偏差为5.1％。 　　6.磁性微粒电化学发光免疫分析法将合成的电化学发光物钌联吡啶衍生 物标记在地高辛抗体上，地高辛标记在磁性微粒上，待测地高辛和标记在磁性微 粒上的地高辛竞争钌联吡啶标记的地高辛抗体，利用磁场分离作用，建立了测定 地高辛的磁性微粒电化学发光免疫分析法。电化学发光信号与地高辛浓度在1.0 ×10ˉ(-8)g/mL～2.0×10ˉ(-6)g/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9898。检 出限为7.5×10ˉ(-9)g/mL。 　　7.碳纳米管糊电极上碱基电化学行为及其分析应用的研究研制了碳纳米 管糊电极，研究了碳纳米管糊电极上碱基的电化学行为，建立了同时测定鸟嘌呤 和腺嘌呤，鸟嘌呤和胞嘧啶的电化学分析新方法。并将其用于DNA序列(小牛 胸腺DNA和合成寡核苷酸)中碱基((G＋C)/(A＋T))比例的测定，结果满意。 　　8.电化学DNA生物传感器的研究以聚吡咯包埋法将单链DNA(ss-DNA) 固定在碳纳米管糊电极上，以溴化乙锭为电化学杂交指示剂，研制了一种高灵敏 度的电化学DNA生物传感器，建立了一种cs-DNA序列分析的电化学分析新方 法。传感器的响应电流与cs-DNA的浓度在5.0×10ˉ(-10)～1.0×10ˉ(-8)mol/L范围内呈良 好的线性关系，相关系数为0.9958，检出限为1.0×10ˉ(-10)mol/L。 　　9.DNA与药物相互作用的研究利用维生素B_6和氧氟沙星与DNA结合前 后电化学行为和紫外可见光谱及荧光光谱的变化，研究了维生素B_6和氧氟沙星与 DNA的相互作用，测定了维生素B_6和氧氟沙星与DNA的结合常数。实验结果 表明，维生素B_6和DNA、氧氟沙星与DNA通过嵌合作用，结合生成非电活性的 超分子化合物。 　　本论文所研制的纳米粒子组装电化学生物传感器和所建立的电化学发光免疫 分析新方法，为生物活性分子的快速灵敏检测提供了良好的分析器件和分析方法。 碳纳米管对氧化还原蛋白或酶在电极上的直接电子转移具有良好的促进作用；可 以提高分子识别物质在电极上的固定量；可以提高电化学检测生物活性物质的灵 敏度和选择性。多标记技术可以提高电化学发光检测生物活性物质的灵敏度。磁 性微粒的容易分离作用大大简化了免疫分析的操作步骤。本论文的研究工作为进 一步研制高灵敏度和高选择性纳米组装电化学和电化学发光生物传感器提供了一 些基础性研究资料，对此方面的研究工作具有一定的促进作用。