题目：剪切场诱导血小板活化现象的生化和力学机制研究

剪切场诱导的血小板活化/聚集现象（shear-induced platelet activation/aggregation, SIPAct/SIPA）被认为是动脉血栓诱发因素。体外实验表明SIPA/SIPAct现象由血浆中溶解性的von Willebrand因子（VWF）与血小板膜糖蛋白GPIb/IX/V的结合触发。二者之间的结合仅发生在高剪切场条件下（＞3000s-1）。这暗示SIPAct/SIPA现象的触发过程是生化-力学因素的耦合过程。本课题用矩形平行平板流动小室循环系统模拟动脉狭窄处局部高剪切场流型，及锥-板显微观测装置制造均匀高剪切场流型，从生化－力学环境耦合的角度出发，围绕剪切场和蛋白质多聚物构象对于SIPAct现象的影响问题设计实验。以人源洗涤血小板和溶解VWF作为主要实验对象，用流式细胞术测定血小板膜上P-selectin的表达及膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻作为血小板活化的双重标志，研究高剪切场SIPAct现象的生化和力学机制。主要研究内容包括：高剪切场流型、剪切场中血小板之间的碰撞频率、血小板活化后促凝释放产物的生化作用、溶解状态VWF浓度及其多聚体状态对SIPAct现象的影响；血小板GPIb/IX/V与VWF结合反应的动力学机制。通过这些研究结果初步构建SIPAct现象触发机制的生化和物理模型，认识动脉血栓的形成机理。主要的研究成果和结论：无外源性VWF存在时，单纯高剪切场不能够引发SIPAct现象；模拟动脉狭窄高剪切场流型实验表明，血小板的活化率与局部高剪切场强度成正相关性；外源性VWF浓度（5-25μg/mL），血小板活化率与VWF浓度成正相关性。P-selectin表达率从7.2 ± 0.6%增至53.4 ± 3.8%（P＜0.05），Annexin V 表达率从16.5 ± 1.2%增至65.9 ± 5.2%（P＜0.05）。实验中VWF的浓度范围大于正常体内范围，推测血浆中高浓度的VWF是致动脉血栓疾病的危险因子之一。均匀高剪切场流型实验表明，血小板碰撞频率是影响SIPAct现象的关键因素之一；对照实验结果表明，血小板活化后的释放产物对于SIPAct现象的正反馈效应不明显；人工提纯制备正常人源VWF多聚体、低多聚态VWF和VWF单体，血小板的活化率与溶解状态VWF多聚体状态成正相关性，VWF构象的多聚体状态是影响SIPAct现象的重要因素之一。采用微吸管操作系统对包被VWF的兔红细胞与表达人血小板GPIb/IX的CHO细胞进行循环黏附实验。实验模型条件下，VWF与GPIb/IX之间的黏附概率为15.0%，解离力呈随机分布状态，解离力的最大几率值为10pN。在本文研究基础上首次提出SIPAct现象的物理模型：溶解性的VWF在剪切场中跟随流场运动，椭球状多聚物的长轴与流线方向比较一致，因此跟随流场运动的VWF多聚物构象需较高剪切场作用才能被打开，暴露出与血小板GPIb/IX/V结合的位点，导致部分血小板与VWF黏附。当VWF多聚物与血小板黏附之后，血小板发生活化，多聚物跟随流场运动的规律改变，推测其椭球的长轴可能不再与流线保持一致，因此VWF的构象更容易受到剪切场作用而打开。在此基础上未活化的血小板与黏附有VWF的血小板发生碰撞、接触造成更多血小板发生SIPAct现象。