● 摘要
摘 要本研究以成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,通过前列腺癌细胞系pc-3分泌物诱导和使用旋转模拟失重装置模拟失重,设置不同的培养条件,在细胞水平上，从细胞的增殖、分化和形态变化方面研究成骨细胞对前列腺癌细胞分泌物刺激的响应和对旋转模拟失重的响应。分子水平上，观察了骨钙素（osteocalcin,ocn），I-型胶原（type-I collagen），骨桥蛋白（osteopontin,opn），c-fos和 -tubulin（内参）这些蛋白的mRNA表达，研究pc-3分泌物和模拟失重两种不同刺激对骨吸收和骨形成平衡的调控。主要内容和结果如下：运用普通细胞株培养方法培养成骨细胞系MC3T3-E1细胞，经过传代扩增足够细胞数量，并通过形态观察、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）表达检测等方法表明细胞具有成骨细胞的典型生物学行为。配制不同比例的含pc-3分泌物的培养液和完全培养液的混合培养液，混合培养液中含pc-3分泌物的培养液的比例分别是25%，50%，75%，以完全培养液培养的细胞为对照，培养细胞三天。细胞从接种到培养瓶三天后，用噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖和活性的情况。实验结果表明，与对照组相比，含分泌物上清液50%组细胞的增殖和活性增强了12%，含分泌物上清液25%和75%组分别降低了3%和15%，含有适量比例pc-3分泌物的培养液促进成骨细胞系MC3T3-E1的增殖和分化。为创造细胞模拟失重条件，购买了整套NASA旋转细胞培养装置，包括旋转竖直平台，圆柱型培养腔，转速控制系统，微载体，胶塞和两通。该装置能够根据细胞的种类、增殖情况，通过调节转速，提供细胞培养的旋转模拟失重培养条件。整套装置组装简便，通过改变初始加入微载体的数量，可以观测出细胞较长时间的增殖情况。该装置取样方便，便于测量细胞的各项生化指标。调节旋转模拟失重装置转速为10r/min模拟微重力效应，在模拟失重条件下培养成骨细胞MC3T3-E1，另外以相同初始条件在培养瓶中培养MC3T3-E1作为对照组。细胞开始培养后五天，每天用噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖的情况，用对硝基酚磷酸脂（PNPP）检测细胞ALP情况。实验结果表明，细胞增殖与分化方面,模拟失重条件与对照组比较, 细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞增殖能力均显著减弱 .对照组从第二天到五天细胞增殖变化不大,而细胞的ALP活性增强,说明每个细胞个体分化能力在加强.而旋转组细胞从第一天到五天增殖能力趋于增强,而分化能力变化不大,说明个体细胞的分化能力在模拟微重力的影响下减弱。.调节旋转模拟失重装置转速为10r/min模拟微重力效应，在模拟失重条件下培养成骨细胞系MC3T3-E1，另外以相同初始条件在培养瓶中培养MC3T3-E1作为对照组。采用RT-PCR在分子水平上检测骨钙素（osteocalcin,ocn），I-型胶原（type-I collagen），骨桥蛋白（osteopontin,opn），c-fos和 -tubulin（内参）这些蛋白的mRNA表达，旋转模拟失重组与对照组相比,c-fos表达显著增强,表明细胞所处力学环境发生改变; ocn，type-I collagen mRNA表达显著减弱 , opn mRNA表达显著增强 . 模拟失重条件减弱成骨细胞MC3T3-E1成骨相关因子的mRNA表达,从而抑制骨形成，增强破骨相关因子的表达，从而促进骨吸收。关键词:微重力, 成骨细胞,增殖,分化, RT-PCR