题目：NSCs递送LINGO-1-Fc治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验研究

研究背景

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是人类多发硬化症（MS）的动物模型。MS是一种由自身免疫反应引起的以炎性脱髓鞘为主要特征的中枢神经系统（CNS）退行性疾病，目前困扰着全球超过250万人的健康。LINGO-1是轴突髓鞘形成的负调控因子，具有抑制轴突生长，阻止髓鞘再生，促进少突胶质细胞和神经元凋亡的作用。在抗炎治疗的基础上，神经干细胞（NSCs）移植被认为可能是治疗该病的一种有效途径。

目 标

      本研究从胎鼠海马中分离NSCs，通过分子生物学手段将其改造成稳定过表达分泌型LINGO-1拮抗剂LINGO-1-Fc的NSCs，研究NSCs递送LINGO-1-Fc是否能通过促进髓鞘再生对EAE小鼠有治疗作用。

方 法

      雌性C57BL/6小鼠被随机分为3组：模型组，GFP-NSCs组，LINGO-1-Fc-NSCs组。在所有实验小鼠经MOG35-55主动免疫后第23天，LINGO-1-Fc-NSCs组经尾静脉注射1×106个LINGO-1-Fc-GFP-NSCs（200ul）、GFP-NSCs组注射1×106个GFP-NSCs（200ul）、模型组注射200ul PBS，每日观察小鼠行为并进行神经功能评分。于免疫后第48天处死，取小鼠脊髓腰骶膨大组织进行组织病理学染色：H&E染色观察炎性细胞浸润、LFB染色观察髓鞘脱失、免疫荧光染色检测内源性和外源性MBP+、GFAP+、NeuN+ 细胞数目，以及小胶质/巨噬细胞的数目和中性粒细胞的浸润；同时采用流式细胞术分析了CNS和脾中CD4+ T细胞亚群的变化。在体外实验中，应用免疫荧光染色研究了LINGO-1-Fc-NSCs培养上清对OPCs增殖和分化的影响。

结 果

1. 利用慢病毒介导的方法建立了稳定表达LINGO-1-Fc的NSCs 细胞株，LINGO-1-Fc感染后48h，NSCs的LINGO-1-Fc分泌量高达195.00±9.75ng/106 cells，显著高于NSCs组和GFP- NSCs组。

2. 本实验中，小鼠从免疫后第13天开始发病，至免疫后第19天进入高峰期，高峰期维持时间较长，细胞移植后13-25天，GFP-NSCs组较模型组显著降低了神经功能评分（P<0.01），而LINGO-1-Fc-NSCs的起效时间比GFP-NSCs早11天，而且作用效果更加明显，在细胞移植后第2天至处死前，LINGO-1-Fc-NSCs组较模型组（P<0.001）和GFP-NSCs组（P<0.05）均显著改善了临床功能评分，将疾病高峰期缩短至6天。

3. HE染色结果显示，相对于模型组（P<0.001）和GFP-NSCs组（P< 0.01），LINGO-1-Fc-NSCs组脊髓“袖套样”结构明显减少，外周炎性细胞浸润面积占脊髓面积的比值显著降低；LFB染色显示，LINGO-1-Fc-NSCs组较其他两组髓鞘脱失比例显著降低。

4. 免疫荧光染色结果：

（1）LINGO-1-Fc-NSCs组较模型组（P<0.01）和GFP-NSCs组（P<0.01）总的MBP荧光强度(MFI)显著增强，LINGO-1-Fc-NSCs组和GFP-NSCs组都有外源性少突胶质细胞（GFP+/MBP+细胞）分化，但两组之间差异不显著；

（2）LINGO-1-Fc-NSCs组和GFP-NSCs组均存在外源性神经元分化，且LINGO- 1-Fc组较GFP-NSCs组外源神经元数目明显增多（P<0.05）；

（3）模型组病灶部位出现明显的星形胶质细胞增生，且伴随有大量的炎性细胞聚集，相对于模型组，GFP-NSCs组和LINGO-1-Fc-NSCs组总的星形胶质细胞（GFAP+）数目和内源性星形胶质细胞（GFAP+/GFP-）数目均明显减少，且LINGO-1-Fc-NSCs组较GFP-NSCs组总的星形胶质细胞数目（P<0.05）和外源性星形胶质细胞（GFAP+/ GFP+）数目（P<0.001）减少；

（4）相对于模型组，LINGO-1-Fc-NSCs组Iba-1+ 细胞数目明显减少（P<0.01），而LINGO-1-Fc-NSCs组较GFP-NSCs组Iba-1+ 细胞数目无明显变化（P=0.066）；

（5）各组小鼠脊髓均有具典型分叶核（多为3叶）的中性粒细胞浸润，且主要分布于脊髓白质，相对于模型组，GFP-NSCs组（P<0.05）和LINGO-1-Fc-NSCs（P<0.01）组Gr-1+细胞数目均显著减少；

5. 流式分析显示，与模型组相比，LINGO-1-Fc-NSCs组降了低外周CD4+/IL-17+比例（P<0.05）。

6. 体外实验表明，和GFP-NSCs组相比，LINGO-1-Fc-NSCs培养上清可抑制OPCs增殖，并促进少突胶质细胞分枝形成，促进OPCs向成熟少突胶质细胞分化。

结 论

1. LINGO-1-Fc-NSCs和GFP-NSCs移植均可缓解EAE病情，但LINGO-1-Fc- NSCs较GFP-NSCs起效时间更早、作用效果更明显；

2. LINGO-Fc-NSCs具有重要的神经修复作用，移植的LINGO-1-Fc-NSCs主要促进内源性少突胶质细胞成熟、促进髓鞘修复和重建、抑制OPCs和内源性星形胶质细胞增生、抑制外源性星形胶质细胞分化、促进外源性神经元分化；

3. 移植的LINGO-1-Fc-NSCs具有明显的免疫调节功能，LINGO-1-Fc- NSCs可抑制外周炎性细胞浸润CNS、抑制外周Th17分化、抑制CNS小胶质/巨噬细胞活化。