题目：鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究

鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究
徐明生

摘要 鸡蛋是人类摄取营养物质的一种重要来源，几乎包含了胚胎发育所需的所有蛋白质、脂质、维生素、矿物质和生长因子。鸡蛋中的蛋白质主要存在于蛋清和蛋黄中，其中蛋清蛋白的种类和含量最为丰富。卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白质，占蛋清蛋白质的54%，是获得生物活性肽的很好资源。本文以鸡蛋卵白蛋白为对象，采用生物酶解、抗氧化试验、离子色谱、反相高效液相色谱、电喷雾质谱等方法，系统研究了酶水解各主要参数，酶解物抗氧化活性，抗氧化肽的分离纯化和结构表征，为开发鸡蛋抗氧化肽产品提供理论基础。主要结果如下：
1．获得了简便、快速、高纯度的鸡蛋卵白蛋白提取工艺路线。采用Q-Sepharose FF阴离子色谱法对鸡蛋卵白蛋白进行分离。通过对蛋清上样量、缓冲液pH值、缓冲液浓度和洗脱液离子强度等优化试验，获得的工艺条件为：鸡蛋蛋清用2倍的水稀释，将其pH调至6.0沉淀去除卵粘蛋白，40mLQ-Sepharose FF阴离子柱分离，蛋清上样量140mL，用0.15mol/L pH8.0的 NaCl水溶液洗脱，可获得1058mg卵白蛋白，卵白蛋白的得率为55%，经反相高效液相色谱检测纯度为92%。
2．以羟自由基清除率为指标，研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解鸡蛋卵白蛋白所得酶解物的抗氧化活性。研究表明胃蛋白酶的酶解物羟自由基清除率最高。
3．确定了酶解物羟自由基清除率≥40%的酶解条件。采用响应曲面分析法对底物浓度[S]、胃蛋白酶添加量[E]、酶解时间进行分析，建立了回归模型，确定了酶解条件，即底物浓度2.22%-3.76%、酶添加量8738.24u/g- 11176.63u/g、水解时间4.05-7.77h。
4．首次采用多种抗氧化活性试验，全面研究了鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性。体外试验结果表明：酶解物对碱性邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子、Fenton 反应产生的羟基自由基、亚油酸氧化体系中亚油酸的氧化均有明显的抑制作用，且呈现一定的量效关系。5mg/mL的鸡蛋卵白蛋白酶解物，对超氧阴离子的抑制率为45%，对羟基自由基清除率为56%，对亚油酸氧化的抑制能力相当于0.2mg/mL VE的抑制能力，均显著高于同浓度的卵白蛋白的抑制能力（p＜0.05）。D-半乳糖复制衰老小鼠模型的体内抗氧化试验的研究结果表明：高、中剂量的鸡蛋卵白蛋白酶解物能极显著抑制衰老小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC活性的下降（p＜0.01）；同时能极显著降低衰老小鼠血清和肝脏MDA的水平（p＜0.01）。
5．探讨了不同分子量的鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性。酶解物用三种不同的超滤膜（MWCO 10, 5 and 3 kDa）分成四个组分。各个组分显示出不同的抗氧化活性，其中分子量小于3 kDa的组分最强。
6．采用离子交换色谱和反相高效液相色谱分离获得了三种鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽。采用Q-Sepharose FF离子交换层析法对低分子量酶解物进行分离，分级等度洗脱，共获得5个组分(OPQ1, OPQ2, OPQ3, OPQ4和OPQ5 )。再将抗氧化能力最强的OPQ3组份用反相高效液相色谱分离纯化，获得了四个肽，其中OPQ3-1、OPQ3-2和OPQ3-4具有较强的抗氧化能力，对羟自由基的清除率分别达到78.6%、81.8%和82.3%。
7．采用ESI-MS/MS，对反相高效液相色谱分离纯化获得的3个抗氧化能力较强的鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的氨基酸序列进行了测定。OPQ3-1的分子量为408.14 Da，由3个氨基酸残基按序列Pro-Glu -Tyr组成；OPQ3-2的分子量为473.19Da，由4个氨基酸残基按序列Leu-Pro-Asp-Glu组成；OPQ3-4的分子量为433.18Da，由3个氨基酸残基按序列Trp-Val-Glu组成。这三个肽分别来源于鸡蛋卵白蛋白第115-117、245-248和148-150氨基酸残基，均属首次从卵白蛋白中分离获得的抗氧化肽。
关键词 鸡蛋卵白蛋白 酶解 抗氧化肽 分离纯化 抗氧化活性