题目：蔗糖磷酸合成酶SPS的克隆及对棉花的遗传转化研究

棉花（Gossypium hirsutum）是全球重要的经济作物之一。棉纤维是一种优良的天然纤维，由于其成本低廉、产出量大、保暖性能好，被视为优良的纺织原材料。随着纺织工业的发展，新的纺织技术越来越需要品质更好，强度更高的棉纤维。近几年，通过常规杂交育种已经获得了多种棉花优良品种，然而由于周期长，优良的种质资源的少，使得棉花杂交育种的进程受到限制。所以，通过基因工程的手段把利于纤维发育并能增强棉花抗逆性的基因转入棉花，提高棉花纤维的产量和品质，增加品种的抗逆性，将为棉花新品种选育提供资源。
蔗糖磷酸合成酶能够催化UDPG和6-磷酸果糖生成6-磷酸蔗糖和UDP，是蔗糖代谢中的关键酶之一。该酶对于细胞次生壁的发育及纤维素的合成具有重要作用，且能影响花的发育；此外，蔗糖磷酸合成酶还能提高植物的抗逆性。本课题以拟南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花为材料，通过RT-PCR获得了拟南芥蔗糖磷酸合成酶基因（AtSPS5.1），并通过gene-walking及over-lap PCR获得棉花蔗糖磷酸合成酶基因（GhSPS1），最后构建了AtSPS5.1-pART过表达载体和GhSPS1-pART干涉载体，对棉花进行遗传转化。其目的，一方面为深入研究棉花中蔗糖磷酸合成酶的功能奠定基础；另一方面培育转基因棉花新种质，为进一步获得纤维品质优异、抗逆性强的的棉花新品种提供材料。
本实验结果如下：
1、通过RT-PCR获得了拟南芥AtSPS5.1基因。该基因全长3251bp，包括3132bp的编码区，编码1043个氨基酸，经与其他物种的SPS基因进行百分相似性分析，发现其相似性均高于60%, 且具有SPS保守的结构域；利用pKannibal和pART27载体，成功构建了AtSPS5.1的过表达载体。
2、采用gene-walking及over-lap PCR的方法，获得了GhSPS1。结果表明，该基因全长4545 bp，包含12个内含子，13个外显子，其开放读码框为3108 bp，编码1035个氨基酸。经生物信息学分析后证实为SPSA家族基因。通过Blast分析选择特异性的片段，成功构建了GhSPS1-pART干涉载体。
3、通过实时荧光定量PCR法对蔗糖合成相关的四个基因（GhSPS1、GhSUS3、GhINV、GhCESA4）进行了组织和纤维发育特异性表达分析，表明GhSPS1和GhSUS3是组成型表达，但在0 DAF、3 DAF的胚珠及18 DAF的纤维中表达量最高，GhINV在3-15 DAF的纤维中表达量较高，GhCESA4在18 DAF的纤维中表达量最高。
4、通过半定量PCR检测GhSPS1基因在不同非生物胁迫条件下的表达模式，结果表明，该基因在干旱条件下表达量有所下降，而在ABA、低温处理条件下表达量增加，在高温胁迫下，表达量先升高后降低。
5、采用不同培养基，培养棉花子叶和下胚轴，诱导其愈伤组织的发生。结果表明，在不同培养基上，下胚轴出愈率均高于子叶，且其生长量也有显著优势；以下胚轴为外植体时，不同培养基上出愈率和愈伤组织状态有差异，其中以MSB+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT+3%葡萄糖为基本培养基，以植物凝胶为凝固剂时表现出明显优势。
6、采用以中棉24、珂字310、珂字312、中棉10四个棉种为材料，探讨了棉花组织培养过程中的褐化现象，结果表明，PVP能够有效延长愈伤组织的培养时间，但不能从根本抑制其褐化；黑暗处理外植体可以抑制外植体的褐化，但难以诱导获得正常的愈伤组织；以葡萄糖为碳源、灭菌时间缩短为15分钟能有效抑制愈伤组织的褐化。
7、本实验优化了农杆菌介导的棉花遗传转化体系，研究了影响转化的因素，结果表明，当农杆菌浓度为OD600=0.4，无菌苗苗龄为9 d，侵染时间为5 min，共培养时间为48 h时，转化效率最高。
8、采用经农杆菌LBA4404对介导的转化法转化棉花（中棉24和中棉10）进行遗传转化，获得了过表达型和干涉型抗性愈伤组织，经初步PCR及RT-PCR检测证明获得了阳性愈伤。对比两种转基因的棉花材料发现，过表达型材料出愈率高，生长状态较好，明显优于干涉型。