题目：冬凌草提取物逆转肿瘤多药耐药性的研究

目的：恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段，肿瘤多药耐药的产生是化疗失败的主要原因，筛选低毒高效的肿瘤多药耐药逆转剂是近几年研究的热点。传统中药具有成本低，毒副作用小，又有千年的研究理论和实践积淀，且对人体的治疗往往是多途径、多靶点，近年来成为逆转MDR的一个新研究方向。中药冬凌草由于其毒副作用小，抗肿瘤效果好而广泛应用于肿瘤的治疗。本实验选择人结肠腺癌Caco-2细胞和人胃癌耐顺铂SGC-7901/DDP细胞作为冬凌草不同化学部位逆转肿瘤多药耐药的研究对象，探讨冬凌草不同化学部位对高表达P-gp的肿瘤细胞及耐药细胞的体外逆转效果。本研究旨拟确认冬凌草逆转肿瘤多药耐药性的活性化学部位，并初步推测其可能的作用机制，为从传统中药冬凌草开发出逆转肿瘤多药耐药的有效成分提供理论基础。
方法:(1)通过回流提取法、索氏连续提取法和水煎煮法来提取冬凌草不同化学部位，采用不同极性的溶剂如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水，按照极性从低到高的次序顺次提取，减压蒸馏除去溶剂，得到冬凌草不同化学部位；
???? (2)以Caco-2细胞为筛选模型，荧光酶标仪检测冬凌草不同化学部位干预下Caco-2细胞内罗丹明（Rho-123）的蓄积量, 初步确定可抑制P-gp活性的阳性化学部位；MTT法检测冬凌草不同化学部位作用于Caco-2细胞后的细胞毒性以及在有无冬凌草不同化学部位处理的情况下，ADM对Caco-2细胞的生长抑制率，并计算Q值。利用流式细胞仪检测冬凌草不同化学部位干预下Caco-2细胞内Rho-123和ADM的蓄积量,初步确定可抑制P-gp活性的化学部位；
(3)利用HPLC测定冬凌草不同活性部位中冬凌草甲素的含量；
(4)将通过Caco-2细胞筛选出的活性化学部位作用于人胃癌SGC-7901细胞和人胃癌耐顺铂SGC-7901/DDP细胞株，进一步验证冬凌草活性部位逆转MDR的活性：
结果：⑴通过回流提取法、索氏连续提取法和水煎煮法提取得到冬凌草石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水五个不同部位的提取物，其提取率分别为0.96%、2.46%、0.36%、1.62%和4.84%；
⑵罗丹明蓄积实验显示冬凌草氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位处理组与细胞作用1h和72h后细胞内荧光强度的增加量与阴性组比较差异显著，冬凌草石油醚部位则作用不显著；
⑶在非细胞毒性范围内，冬凌草氯仿部位、冬凌草乙酸乙酯部位和冬凌草水部位作用Caco-2后，均能增加Caco-2细胞内Rho-123和ADM的荧光强度，而冬凌草正丁醇部位不能增加Caco-2细胞内ADM的荧光强度。冬凌草氯仿部位和冬凌草乙酸乙酯部位与1μg/mLADM联合作用Caco-2细胞后，两药联合效果为协同作用，冬凌草水部位与1μg/mLADM联合作用Caco-2细胞后，其协同效果为相加作用，而冬凌草正丁醇部位与ADM联用后的作用为拮抗作用，因此确定冬凌草氯仿、乙酸乙酯和水等部位作为初步的活性化学部位，进行后续实验；
⑷ 利用HPLC测定冬凌草不同化学部位中冬凌草甲素的含量，测得冬凌草氯仿、乙酸乙酯和正丁醇部位中冬凌草甲素的含量分别为0.5%、1.05%和0.58%，冬凌草水部位中不含有冬凌草甲素；
⑸MTT法检测化疗药物DDP和ADM对SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的细胞毒性作用，计算得到DDP对SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的IC50分别为6.53和18.11，耐药倍数为2.77；ADM对SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的IC50分别为1.40和3.78，耐药倍数为2.70；经维拉帕米、冬凌草甲素（2.4μM、4.8μM）、冬凌草氯仿部位（20μg/mL、100μg/mL）、乙酸乙酯部位（20μg/mL、100μg/mL）、水部位（4μg/mL、20μg/mL）处理细胞后得到逆转后IC50分别为：3.20、3.73、3.49、7.22、6.46、7.91、5.75、12.28、11.06，逆转倍数分别为5.65、4.86、5.18、2.51、2.8、2.29、3.15、1.47、1.64倍，且呈剂量依赖；
⑹在非细胞毒性范围内，冬凌草甲素、冬凌草氯仿部位、乙酸乙酯部位和水部位作用SGC-7901/DDP后，均能增加SGC-7901/DDP细胞内Rho-123和ADM的荧光强度，且冬凌草乙酸乙酯部位和氯仿部位作用效果优于冬凌草甲素。冬凌草甲素、冬凌草氯仿部位、冬凌草乙酸乙酯部位与ADM联合作用SGC-7901/DDP细胞后，两药联合效果为协同作用，且冬凌草乙酸乙酯部位的效果要优于冬凌草甲素和冬凌草氯仿部位。
结论：无毒剂量的冬凌草氯仿部位、乙酸乙酯部位、水部位作用Caco-2和SGC-7901/DDP细胞后，可以提高Caco-2和SGC-7901/DDP细胞对化疗药物的敏感性，说明其具有逆转肿瘤多药耐药现象；冬凌草中具有逆转多药耐药性的有效成分不仅仅是冬凌草甲素，还有其他成分。