● 摘要
本文探讨银线草（Chloranthus japonicus Sieb.）提取物（CJ）和多穗金粟兰（Chloranthus multistachys Pei）提取物（CM）诱导人结肠癌Lovo细胞凋亡的分子机制。银线草和多穗金粟兰属于金粟兰科Chioranthaceae金粟兰属Chloranthus植物，该属植物的化学成分主要包括萜类、香豆素类、黄酮类、酰胺类、有机酸、甾体及甾体皂苷等类型化合物，多全草或根入药，在我国民间广泛应用于治疗跌打损伤、风湿痛、毒蛇咬伤等病症。近年来有研究表明银线草可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，但并未深入研究其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制，而对CM诱导肿瘤细胞凋亡的研究尚未见报道。
本实验运用MTT法、显微观察法、流式细胞术和Western Blot等方法，探讨银线草提取物（CJ）和多穗金粟兰提取物（CM）的抗肿瘤作用，揭示这两种植物提取物诱导Lovo细胞凋亡的分子机制，同时也为中药治疗肿瘤提供理论根据。论文主要结果如下：
1. CJ和CM对三种肿瘤细胞系的体外抑制增殖作用。将CJ和CM分别作用于Caco-2、Lovo、MCF-7细胞72h后，用MTT法检测，在62.5-1000μg/ml浓度范围内对这三种细胞的增殖均有抑制作用，生长抑制率随提取物剂量的增加均呈逐渐加强趋势，表现出明显的剂量和效应依赖关系。用直线回归方程统计结果，求出IC50值。根据求得的IC50值得出，这两种植物提取物均对Lovo细胞敏感，因此选择Lovo细胞作为后续的研究对象。
2. MTT法检测CJ和CM对Lovo细胞增殖的影响。不同浓度梯度的CJ和CM分别作用Lovo细胞24、48、72h后，用MTT法检测细胞增殖抑制情况，结果显示同一时间增殖抑制率与浓度正相关，随作用时间延长，抑制率逐渐升高，即呈明显的浓度-时间依赖关系。
3. CJ和CM作用Lovo细胞48h后倒置显微镜下形态学观察。将CJ和CM干预Lovo细胞48h后，倒置显微镜下观察Lovo细胞形态，与对照组比较，细胞生长状态变差，细胞数目减少，细胞贴壁能力下降，细胞之间的连接减少，细胞与细胞之间几乎不能连接成片而出现空隙，高浓度提取物作用后，细胞碎片增加、背景颗粒增多，出现较多细胞悬浮现象。随着给药浓度的增加，细胞状态渐差，最大浓度药物作用后的细胞，出现大量细胞的死亡和崩解，细胞之间出现较大的空隙，培养液中漂浮着大量死亡的脱壁细胞。
4.CJ和CM作用Lovo细胞48h后Hoechst33258荧光染色观察。将CJ和CM干预Lovo细胞48h后，Hoechst33258染色在荧光显微镜下观察，经药物处理后的细胞，部分细胞核体积减小，细胞的核由于浓集着色深而呈亮兰色，聚集于核周边或裂解成碎片。
5．CJ和CM分别作用Lovo细胞24h、48h后Annexin V-FITC/PI 检测细胞凋亡率。经FCM检测、相关软件分析，加入250μg/ml，500μg/ml，1000μg/mlCJ作用24h后早期凋亡率分别10.97%、15.33%、18.77%；作用48h后早期凋亡率分别18.77%、21.20%、54.93%。加入250μg/ml，500μg/ml，1000μg/mlCM作用24h后早期凋亡率分别10.67%、12.9%、15.57%；作用48h后早期凋亡率分别10.43%、16.97%、47.10%。
6．CJ和CM分别作用Lovo细胞48h后细胞周期时相中DNA含量测定。不同浓度CJ和CM250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml作用于Lovo细胞48h后，随药物浓度的升高，细胞周期各时相分布发生明显改变，S期DNA含量增多，G2/M期DNA含量减少，表明细胞周期被阻滞在S期。
7. CJ和CM分别作用Lovo细胞48h后细胞凋亡相关蛋白表达的检测。Western blot结果显示：不同浓度的CJ和CM处理Lovo细胞48h后，caspase-3，8，9酶原被活化，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。初步说明这两种提取物诱导细胞凋亡时，可能通过细胞内和细胞外途径共同起作用而实现细胞凋亡。