题目：人泡沫逆转录病毒LTR和IP启动子的活性研究

泡沫逆转录病毒（Foamy virus, FV）属于逆转录病毒科（Retroviridae）泡沫病毒亚科（Spumaretrovirinae）泡沫病毒属。因其感染细胞后可诱导产生类似泡沫的空泡、多核细胞而得名。泡沫病毒宿主范围广，能在宿主体内建立终身的持续性感染而无明显致病性。它还具有广泛的细胞趋性，能感染多种类型的细胞。泡沫病毒的基因组较长，基因装载容量大，能携带较大的外源基因。这些特点使它成为基因治疗载体的研究热点。
与其他逆转录病毒不同的是，FV不仅具有经典的5′ LTR启动子（简称LTR），在env基因3′末端还有一个内部启动子（Internal promoter, IP）。前者主要调控泡沫病毒结构蛋白Gag、Pol、Env的基因转录和表达，后者则调控PFV辅助蛋白Bel1/Tas和Bet的基因转录和表达。Bel1/Tas是反式激活因子，它能够与LTR和IP结合，反式激活启动子，两个启动子的活性都强烈依赖于Bel1/Tas。LTR和IP不仅基础活性不同，而且在泡沫病毒感染的不同细胞内活性也不相同。这是由于不仅有病毒因子参与对病毒启动子LTR和IP的活性调节，也有宿主细胞的某些因子对病毒启动子的活性产生影响，进而对病毒的复制产生影响。泡沫病毒对不同细胞的感染情况不同，在某些细胞内发生裂解感染，如BHK-21、U87-MG、HT1080、等；在某些细胞内发生潜伏感染，如Jurkat、Raji、293T、U937细胞等。这与病毒和宿主细胞的相互作用有关。
病毒侵染宿主细胞后会激活宿主细胞的免疫系统，如细胞内经典的免疫调控通路—NF-κB信号通路。NF-κB，即核因子κB，是细胞中的一类重要转录因子，在细胞增殖、发育、分化、存活以及免疫、炎症反应过程中参与基因的表达与调控。与此同时，病毒也进化出相应的策略调节细胞的NF-κB信号通路，利用宿主细胞某些因子完成病毒自身复制。
本实验以人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV)全长克隆pHSRV13质粒为模板，设计特异性引物PCR扩增启动子LTR和IP的序列，将它们分别克隆到含有荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-Basic中，构建重组载体。通过瞬时转染细胞检测荧光素酶报告基因的表达量，分析比较HFV LTR和IP两类启动子的基础活性以及在反式激活因子Bel1/Tas作用下的激活活性，探寻这两类启动子在HFV感染不同类型细胞中的活性变化规律。同时，研究泡沫病毒的反式激活因子Bel1/Tas与宿主细胞NF-κB的作用以及NF-κB对病毒启动子LTR和IP活性的调节作用。本论文取得的成果如下：
1.构建LTR和IP系列荧光素酶报告基因表达载体：PCR扩增启动子LTR（1-1121）、LTR（1-780）、IP（9019-9195）、IP（9019-9438）序列，将它们分别克隆到含荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-Basic上，通过菌落PCR、酶切鉴定和测序对重组子进行鉴定，确定报告基因载体构建成功。
2.构建pCI-bel1/tas真核表达载体：PCR扩增bel1/tas基因约1 kb，将目的片段与载体连接后，对重组子进行菌落PCR筛选和酶切鉴定。将测序结果与模板pHSRV13进行序列比对，结果与预期相符，说明pCI-bel1/tas真核表达载体构建成功。
3.LTR和IP系列报告基因质粒的瞬时转染：提取去内毒素的质粒pGL3-LTR（1-1121）、pGL3-LTR（1-780）、pGL3-IP（9019-9195）、pGL3-IP（9019-9438）、pCI-bel1/tas，利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将上述启动子质粒瞬时转染BHK-21、HT1080、HeLa、U87-MG等细胞，同时共转染pCI-bel1/tas表达质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统对荧光素酶报告基因的表达量进行检测，对启动子活性分析发现，LTR基础活性低于IP的基础活性。当LTR和IP被Bel1/Tas反式激活后，LTR（1-780）（即LTR U3区）的激活活性高于LTR（1-1121）（即LTR全长）的激活活性，由此推测，LTR启动子的U3区对LTR启动子的转录活性具有正调控作用，而RU5区对LTR启动子的活性有负调控作用。IP核心序列在HFV原病毒基因组DNA上位于第9019-9195 nt，而IP（9019-9438）的激活活性高于IP（9019-9195）（即IP核心区）的激活活性，因此可能有细胞因子作用于IP核心序列的下游参与调控IP的活性。
4.NFκB-TA-luc报告质粒与pCI-bel1/tas质粒的瞬时转染：提取去内毒素的质粒NFκB-TA-luc、pCI-bel1/tas和pCI-neo，共转染NFκB-TA-luc和pCI-bel1/tas作为实验组，以NFκB-TA-luc和pCI-neo共转染组作为阴性对照，通过双荧光素酶报告基因检测系统对荧光素酶报告基因的表达量进行检测，结果分析表明：病毒因子Bel1/Tas能够与宿主细胞NF-κB发生相互作用。