● 摘要
摘 要
生物正常新陈代谢过程中产生的活性氧族（Reactive Oxygen Species, ROS），如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等，会造成核酸、蛋白质、脂质以及生物膜的氧化损伤。为了应对氧化损害，生物体形成了有效的抗氧化系统，降低ROS等氧化物质的量，将机体的氧化还原状态维持在一个适当的水平。
东亚三角涡虫(Dugesia japonica)属于扁形动物门中营自由生活的类群，是扁形动物门的代表动物之一。大多数生物体内存在两个经典的抗氧化系统，分别是谷胱甘肽系统（GSH系统）和硫氧还蛋白系统（Trx系统）。而在涡虫体内还存在第三个抗氧化系统—硫氧还蛋白谷胱甘肽系统（TGR系统）。扁形动物门中营寄生生活的类群则只有TGR一个系统。
本文以东亚三角涡虫为实验动物，分别对实验室前期克隆的抗氧化系统三个关键基因TGR (Thioredoxin glutathione reductase)、TR (Thioredoxin reductase)及GR (glutathione reductase)的cDNA全长序列进行生物信息学分析，初步掌握了这些基因的信息。利用Real-time PCR技术对谷胱甘肽系统的相关基因γ-GCS (γ-glutamylcysteine synthetase)、GS (glutathione synthetase)、GST (glutathione S-transferase)、GSH-PX (glutathione peroxidases)和GR在氧化胁迫和重金属胁迫下表达量的变化进行检测。通过绝对定量方法，对正常生长状况下涡虫体内抗氧化系统关键基因TGR、TR及GR的表达模式进行了分析。最后利用RNA干扰技术沉默TGR基因的表达，同时检测三个抗氧化系统关键基因表达量的变化，研究三个抗氧化系统之间的相互关系。得到的结论如下：
1. TGR基因cDNA全长为2198 bp，由85 bp的5′-UTR、328 bp的3′-UTR 和1785 bp的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）组成，编码594个氨基酸残基；TR基因cDNA全长为1982 bp，由185 bp的5′-UTR、207 bp的3′-UTR 和1590 bp的ORF组成，编码529个氨基酸残基；GR基因cDNA全长为1465 bp，由19 bp5′UTR、66 bp3′UTR和1380 bp的ORF组成，编码460个氨基酸残基。
2. 利用Real-time PCR技术对GSH系统相关基因γ-GCS、GS、GR、GST，和GSH-PX在氧化胁迫条件下基因表达变化。用200 mM H2O2对东亚三角涡虫进行处理之后，所有基因的表达量均有明显的上调。其中GST在处理1.5 h之后基因表达量上调最为明显，随着处理时间的延长，其表达量开始下降。GR、GS和GSH-PX在处理1.5 h之后基因表达量显著上调，随后表达量开始下降。γ-GCS在所有的处理时间基因表达量的上调均十分显著。
3. 利用Real-time PCR技术对GSH系统相关基因γ-GCS、GS、GR、GST，和GSH-PX在重金属胁迫条件下基因表达变化。在铜离子胁迫条件下，所有5个基因在处理浓度为1.0 mg/L时基因表达量均表现出明显的上调，而后随着处理浓度的升高，表达量下降。与铜离子相似，镉离子胁迫条件下，所有5个基因在处理浓度为0.5 mg/L时基因表达量均表现出明显的上调，随后表达量下降。
4. 利用Real-time PCR技术对涡虫TGR、TR及GR基因的表达模式进行了绝对定量的分析，结果表明TGR的表达量为每μg总RNA 417.54个分子数；TR的表达量为每μg总RNA 101.27个分子数；GR的表达量为每μg总RNA 43.09个分子数。TGR的实际表达量远高于GR和TR，我们推测TGR系统在涡虫体内发挥主要的抗氧化作用。
5. 利用RNA干扰技术沉默TGR基因的表达，Real time PCR检测三个抗氧化系统关键基因的表达量。结果显示，经过5 ng/μL siRNA3的处理，RNA干扰靶基因TGR的表达量从正常水平的每μg总RNA 417.54个分子数降低至每μg总RNA 206.43个分子数，抑制了51%的基因表达。TR的表达量则从原先的每μg总RNA 101.27个分子数上升到每μg总RNA 240.16个分子数。而GR的表达量也从处理前的每μg总RNA 43.09个分子数上升到处理后的每μg总RNA 156.98个分子数。三个抗氧化系统关键基因表达量的变化，说明这三个系统之间存在补偿作用。