题目：hL52基因的功能研究

　　在寻找新型造血调控基因时，从小鼠骨髓造血基质细胞中通过抑制性 差减杂交(SSH)技术筛选获得的一条新基因，即mL52号基因，由于mL52基因 与人的基因具有100％的同源性，因此人的该同源基因命名为hL52基因。 　　本研究是以前期的基因序列及蛋白质结构等研究为基础,主要目的是揭示该 基因的功能，研究hL52基因表达产物的生物学作用。根据DNAStar软件对其蛋白 质序列进行的结构分析推测其可能为一种抗菌肽。但hL52是否是抗菌肽基因，还 未得到证明，本实验通过hL52特异蛋白表达、抑菌实验、转基因等方法对其功能 进行研究。 　　1.通过SDS-PAGE试图获得hL52的特异性表达蛋白。将hL52基因连接在 pET22b(+)的载体上，并将连接好的载体转化到大肠杆菌BL21中，同时用空 载体pET22b(+)做阴性对照。将pET22b(+)-hL52(no tag)转化后的BL21 涂于含有氨苄的琼脂板，进行筛选，挑长出的克隆进行培养，提质粒并进行酶切 鉴定，选一个阳性克隆和一个阴性克隆，再选一个转入空载的克隆，每个克隆再 分成两部分，一部分在摇菌过程中加入IPTG诱导，一部分不加IPTG，一段时间 后将菌液离心，弃上清收沉淀，加细胞裂解液将菌裂解，将裂解液做SDS-PAGE， 结果没有发现诱导后的BL21有特异条带的产生。说明hL52基因的表达产物在产 生后可能立即发挥其生物学作用从而被迅速降解，故无法在PAGE胶上看到特异 的蛋白表达条带。 　　2.验证HL52蛋白是否具有抑菌作用。将pET22b(+)-hL52(no tag)转 化后的BL21阳性克隆进行液体培养，在培养过程中加IPTG诱导该基因的表达， 实验通过多组对照以大肠杆菌的生长是否受到抑制，证明hL52基因的表达产物的 抗菌活性。实验结果显示，pET22b(+)-hL52(no tag)转化后的BL21经IPTG 诱导后，大肠杆菌BL21的生长明显地受到抑制，证明hL52基因的表达产物确具 有抗菌活性。 　　3.hL52基因的表达产物对真核细胞的作用。在胞外即细胞培养液中加入含有 HL52蛋白的酵母上清。选用毕赤酵母(Pichia)构建了酵母生物反应器，将pPIC 9K-hL52转入毕赤酵母中，向培养液中加入甲醇，可诱导产生外源基因hL52的 表达蛋白，离心取培养液上清，将该上清加到生长状态良好的真核细胞HepG2的 培养液中，并以HepG2细胞培养液中不加酵母上清，和HepG2细胞培养液中加不 表达外源基因hL52的酵母上清作为两组对照。结果加用甲醛诱导后的上清的细胞 存活时间最长。 　　4.向细胞内knock-in该基因的实验。构建载体pCDNA31-hL52(no tag)，转染进 HepG2细胞中，构建稳定表达株，同步做一组阴性对照，即转入空载的稳定表达 株。待稳定表达株建好后，回收两组细胞测FACS，结果显示细胞的停留在G0／G1 期的细胞较多。 　　综合以上实验结果我们可以得出以下结论：hL52基因的表达产物确实为抗菌 肽，且具有明显的抑菌效果；对真核细胞还具有延长细胞周期的作用，具体表现 为使细胞停留在G0／G1期的时间延长，细胞的增殖就会相应减慢，从而对培养液 中营养成分的消耗也变慢，所以加入用甲醛诱导后的酵母上清的细胞存活时间最 长。 　　但有关hL52基因的表达产物是通过何种作用机制使得真核细胞的细胞周期延 长，这个将有待于进一步的研究。