题目：丹参、豇豆钙调蛋白基因的克隆及分析

钙调蛋白（Calmodulin）是一种小分子酸性、耐热蛋白，等电点在3.9～4.3之间。钙调蛋白普遍存在于真核生物中，它的结构比较保守、变异小，在钙离子信号系统中起重要作用。钙调蛋白生理功能涉及面广泛：酶活性调节、激酶反应、细胞分裂与分化、细胞骨架与细胞运动、细胞分泌和渗透调节、光合作用、光形态建成、离子吸收转运、植物生殖生育、激素反应、细胞膜通道及基因表达调控等方面。迄今为止已成功地克隆了大麦、大豆、甘蓝、拟南芥、玉米等植物的钙调蛋白基因。
丹参为唇形科多年生草本植物，是我国的一种传统中药材。它在多方面有药用作用：预防心、脑血管疾病、抗肿瘤、抗炎症、抗病原微生物、抗氧化、抗衰老、促进修复再生等。我国数千年来应用传统中药治疗预防疾病，中草药是中华民族知识宝库中的重要组成部分。豇豆是一种常用蔬菜，其营养价值很高，含多种蛋白质、糖类、磷、铁、钙、和维生素及尼克酸，食物纤维等营养成分。丹参和豇豆钙调蛋白基因的克隆均未见报道。
本研究从丹参和豇豆叶片中提取总RNA。使用四种方法提取丹参总RNA：异硫氰酸胍法、CTAB硼砂法、SDS酸酚法、总核酸提取法。使用异硫氰酸胍法提取豇豆总RNA。通过比较各种提取丹参总RNA的方法，发现使用异硫氰酸胍法不仅方法简单、步骤较少，而且得到的丹参总RNA质量较高、产量较大，可以成功的应用于下游分子生物学实验。讨论了在不同条件下提取植物总RNA的影响因素，得出以下结论：研磨过程应适当增长，并保证植物材料浸泡在液氮中；整个实验过程应尽量在低温下进行，如果实验要求高温，也应适当减少植物总RNA处于高温的时间；多次乙醇洗涤有可能造成RNA降解或流失；植物总RNA提取最好采用幼嫩叶片作为材料，避免使用含杂质较多的子叶、茎等部位。
本研究克隆了丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）、豇豆（Vigna unguiculata (L.)Walp）钙调蛋白基因,并对基因结构进行了分析。从丹参叶片中提取总RNA，逆转录为cDNA。通过PCR，扩增得到丹参钙调蛋白基因。丹参钙调蛋白cDNA全长454bp，包含了完整的读码框，含有:腺嘌呤脱氧核糖核苷酸（A） 123个（27.1%），胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）93个（20.1%），鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸（G）134个（29.5%），胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（T）104个（22.9%），编码了150个氨基酸。与已知的多种植物钙调蛋白基因相比有很高的相似性，核苷酸序列相似性在80%以上，编码的氨基酸序列相似在90%以上。在Genebank进行了注册，注册号为AY657030。
豇豆钙调蛋白基因由450个核苷酸组成，含有A 128个（27.6%），C 97个（20.9%），G 133个（28.7%），T 106个（22.8%），编码150个氨基酸。与已知的多种植物钙调蛋白基因相比有很高的相似性。在Genebank进行了注册，注册号为DQ398935。
钙调蛋白基因高度的相似性表明钙调蛋白进化较为缓慢，从而也说明钙调蛋白在植物体内起着重要的作用，不轻易产生突变。
经过结构分析，发现丹参和豇豆钙调蛋白基因推导出的氨基酸序列都具有四个相同的EF-hands（钙离子结合位点）。丹参和豇豆钙调蛋白氨基酸密码子选用具有不平衡性和偏好性。经软件分析，证明丹参和豇豆钙调蛋白的亲水性要强于疏水性。
使用地高辛Southern杂交试剂盒标记探针，通过Southern杂交测定了丹参钙调蛋白基因的拷贝数至少为双拷贝。
将克隆到的丹参钙调蛋白基因反向插入Cambia1304植物表达载体中，酶切结果表明，构建了丹参钙调蛋白基因反义植物表达载体。为进一步的研究丹参钙调蛋白的功能奠定了基础。