● 摘要
丹参为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，是我国常用大宗药材之一，应用广泛，具有通经止痛，活血祛瘀，清心除烦等作用。近年来，丹参作为药用植物次生代谢途径研究的理想材料，被誉为“模式药用植物”。伴随着对丹参主要化学成分分析及相关药理作用的研究，丹参的资源开发和利用研究发展迅速，其需求量不断扩大。然而丹参野生资源匮乏，人工栽培品种良莠不齐，易受到不良环境的影响等导致丹参的产量和质量逐年下降，其中低温寒害是影响丹参生长的重要环境因素之一。低温寒害是植物生长过程中一种常见的逆境胁迫，它限制了植物的产量、地理分布以及生长季节，较为严重的冷害甚至造成绝产。然而植物抗逆性状本身的复杂性及其与数量性状位点连锁关系的复杂性，采用传统的育种方法难以获得抗寒优良品种。随着转基因技术的发展，导入外源基因提高植物抗逆性已成为现代植物育种的主要手段。因此利用生物技术手段改良丹参品种，对提高丹参的抗逆性具有一定的意义。
现有研究表明，拟南芥ICE1基因的cDNA全长为2046 bp，包含长度为1485 bp的开放阅读框，可编码一种具bHLH结构的蛋白。在低温诱导的条件下，ICE1可特异性结合于CBF3启动子区域的MYC顺式作用元件上，激发其转录翻译。CBF3基因又与下游COR基因启动子上的CRT/DRE调控元件相互识别并特异性结合，使得COR基因表达上调，这三种基因串联成了一个级联放大反应，在植株的抗寒性方面发挥重要作用。
本课题在此基础上，从拟南芥中克隆得到ICE1基因，构建其过表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转化丹参，获得过表达的转基因植株。在低温处理条件下，检测转基因植株与对照植株在抗氧化酶活性、抗氧化剂含量以及丙二醛含量等方面的变化，探讨ICE1转基因植株的抗逆能力，为进一步获得抗寒丹参奠定基础。
主要结果及结论如下：
(1) 扩增得到1725 bp的条带，经过在线序列比对，与GENBANK中己公布的拟南芥ICE1基因序列一致，包含有完整的开放读码框为1485 bp。
(2) 经丹参gDNA和cDNA水平的PCR检测：获得8个基因稳定整合并表达的丹参阳性转化株系。进一步采用荧光实时定量PCR技术检测ICE1基因在各转化株系中的表达情况。结果表明：ICE1基因在8个ICE1株系中均具有不同程度的表达，其中基因表达量较高的3个转基因株系是ICE-5，ICE-7和ICE-15。
(3) 将转ICE1基因丹参及转空载对照丹参放入4 ℃培养箱冷处理后，转基因丹参再生植株明显比同龄对照植株更具有耐寒性。冷处理前两种丹参植株生长状况良好，表型上无明显差异。冷处理15 d 后，90 %转空载对照丹参植株出现部分叶片向内卷缩、颜色变黄及下垂的冷害现象，植株有枯萎趋势，说明其生理生化代谢功能已受到严重损伤，而转ICE1基因植株枯萎程度明显轻于转空载对照植株，褪绿现象不明显，叶片也只有轻微的失水萎蔫和下垂现象，植株整体表现的冷害现象要明显轻于转空载植株。实验结果表明转基因丹参株系能够在长时间的低温环境下生存，具有较强的耐寒性。
(4) ICE1过表达株系、空载对照株系和野生株系在正常培养条件下生理指标没有明显差异。在低温胁迫的环境下，相对于对照丹参植株，转ICE1植株的丙二醛含量增加缓慢，低温处理1 d、2 d、4 d、8 d时分别低于对照植株14 %、34 %、40 %和46 %。说明外源基因ICE1可能在提高细胞膜脂的抗氧化能力上起到一定的作用。
在低温胁迫的过程中，转基因丹参植株的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性均一直高于对照植株，活性最强时分别为对照植株的1.5、1.47和1.48倍；而还原型谷胱甘肽和抗坏血酸含量却低于对照植株，在低温处理的过程中，转基因株系的抗氧化剂降低速率较快，在低温处理8 d时，对照植株的还原型谷胱甘肽和抗坏血酸含量分别是同期转基因植株的1.3和1.7倍，表明转ICE1基因植株的抗氧化活动更为旺盛。