题目：霍乱霉素B亚单位（CtxB）在痢疾杆菌中表达

　　霍乱弧菌（V.cholera）是一种曾经严重威胁人类生存，迄今仍对人类健康构成威胁的烈性病原体，其最主要的致病因子是霍乱霉素（cholera toxin, CT）。完整的霍乱霉素由一个A亚单位和5个B亚单位组成。其中A亚单位是毒力活性部分，具有ADP-核糖基转移酶活性；B亚单位毒副作用很小，但能识别所结合细胞表面的受体--神经节苷脂（G ），是霍乱弧菌主要的保护性抗原之一。CtxB加灭活的霍乱弧菌死菌苗的免疫效果远胜于单纯的死菌苗的免疫效果。因此CtxB的高效表达受到研究者的极大重视。研究发现，无论核酸序列还是氨基酸序列，霍乱弧菌的CT和大肠杆菌的肠霉素（LT）具有70%－80%的同源性，所以对CtxB基因在大肠杆菌中的高效表达研究得比较多，但对于其在异源疫苗中的表达，研究相对较少。痢疾是一种常见和多发性传染病，全球每年有2亿人次患细菌性痢疾，死亡650万人，痢疾菌是患病的主要原因。痢疾菌分为四群：痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌。痢疾的流行型别有地区特点。我国以福氏志贺氏菌为主，近年来在城镇郊区宋内志贺氏菌有升高的趋势。发展疫苗是预防痢疾流行的重要途径。目前有两个双价苗已经通过鉴定。但在这两个双价苗中一个由于含转座子而导致整个表达系统不稳定；另一个存在抗药性基因，药物抗性在菌株之间的传播会增加治疗的难度，所以有抗药性的疫苗是不能用于临床的。为了克服这一缺点，军事医学科学院生物工程研究所基因工程室利用载体/宿主平衡致死系统构建了抗宋氏和福氏2a的双价菌苗候选株2457TDL1。其基本的思路为野生型福氏2a 2457T株中的asd基因缺失，（asd基因是细菌的管家基因，编码天冬氨酸半醛脱氢酶，是细菌赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸--DAP合成途径中的一种关键酶），形成的突变体在LB培养基中的生长倚赖于DAP的存在。然后将asd基因克隆至含0-抗原基因的宋内I相大质粒中，转化asd 的突变体后，恢复了突变体在LB培养基中的生长能力，这样就构建成了以asd基因作为筛选标志的载体/宿主平衡致死系统。2457TDI1菌株的优点是在没有任何抗药性作选择压力的情况下，表达外源保护性抗原的质粒在宿主菌中能稳定存在。 就目前的发展来看，单独预防霍乱和痢疾的疫苗已经存在，但令人满意的联合疫苗还没上市，而构建联合疫苗又是当今的发展趋势。所以本实验的目的就是在上述已经构建好的二价痢疾疫苗2457TDI1中引进编码霍乱霉素B亚单位的基因ctxB，使ctxB基因在异源疫苗株中稳定表达，最终形成抗霍乱和痢疾的多价疫苗候选株。 为达到这一目的，我们完成了一下工作： 1．以DH5α(PMT999)为模板，成功克隆了Hg抗性基因片段。 重组质粒在宿主菌中的稳定存在需要有外界的抗性选择压力，随着抗药性菌株的出现和扩散，传统的抗生素作为筛选标志的方法，已经不受欢迎，所以我们选择了Hg抗性基因作为CtxB表达载体的筛选标志。Hg抗性基因来源于pMT中的转座子Tn501，在此转座子中含有完整的Hg抗性基因操纵子，全长2922bp,包括merR, merT, merC, merA .其中merR编码调节蛋白；merT,merC编码转运蛋白；merA编码还原酶。实验以实验DH5α(PMT999)为模板，通过全菌PRC扩增出汞抗性基因片段，电泳图谱鉴定，证明正确。 2．成功构建了CtxB的表达载体pBRC09。 外源性基因高效表达，理论上要求载体中有强启动子和高拷贝复制存在。但本实验中CtxB的过高表达对细胞有一定的毒害作用，而且会占用细胞内过多的资源二导致细胞死亡，所以实验选用了中等强度的启动子和中度拷贝复制子。 （1）用EcoR I 和Bgl II 双酶消化质粒pMGL102回收的片段中除去ctxB的完整序列外，还包括β-lactamase启动子，即内酰胺酶启动子（中等强度的启动子）、而且在回收的长约1.8Kb的片段中还含有Xbal-Cla I 之间的序列，根据曹诚等人的研究表明，该序列也具有一定的启动子活性。通过β-lactamase 启动子和具有启动子活性的序列，就使得CtxB有效但又不过量表达。当然在表达载体中，还须有终止子的存在，有资料表明，在ctxB中就包含了自身的起始和终止信号。 （2）载体中复制自的拷贝数与外源基因的表达效率有一定的关系。一般来讲，复制子的拷贝数越高，其外源基因的表达也就越高。pBR322的复制子，为中度拷贝复制子，其拷贝数大约在20－30之间，被本实验所采用。 PCR扩增、酶切回收后，将Hg抗性基因片段、ctxB片段、pBR322复制子片段连接，转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆并酶切鉴定，证明正确，命名为pBRC09。 3．ELISA和Western blot 检测了CtxB在痢疾杆菌中的表达。 用电穿孔法将构建成功的pBRC09转化至双价菌苗2457TDI1中，并通过ELISA检测了CtxB表达，P /N值为38.65；然后用Western blot 进一步证明了CtxB在痢疾杆菌中高效表达，并将此重构菌命名为2457TC。 4．用2457TC进行动物免疫实验，ELISA检测了抗CtxB的抗血清效价。 免疫学中常用的实验动物使家兔，由于其对抗原的免疫反应性较好，抗体较均一，其IgG不分亚类，实验中易于管理，另外制备出第一抗体后，又能方便地制备羊抗兔IgG,作为第二抗体。所以我们选取日本大耳白家兔3只，用2457TC进行免疫，在免疫第四次后，耳动脉采血，分离血清，用ELISA检测了抗CtxB特异性抗体地滴度，其效价为1280。说明CtxB地表达水平很高。 综上所述，为使霍乱霉素B亚单位（CtxB）在痢疾杆菌中高效表达，本实验以克隆地Hg抗性基因片段作为筛选标志，构建了CtxB的表达载体pBRC09；然后将其转化至双价痢疾菌苗2457TDI1中，ELISA和Western blot 检测证明CtxB在痢疾杆菌中高效表达；并将形成的重组菌2457TC进行了动物免疫实验，其ELISA检测抗体滴度为1280，说明2457TC有很好的免疫原性。因此，2457TC可能使预防痢疾和霍乱理想的菌苗候选株。