● 摘要
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国的大宗药材之一，其有效成分被制成多种生物制剂用于临床治疗，已取得良好疗效。随着丹参市场需求的不断扩大，丹参资源供不应求。采用药用植物细胞工程、基因工程和代谢工程等现代生物技术提高丹参次生代谢产物含量、培育优良品种，已经成为解决丹参供求矛盾和获得优质高产稳产丹参新品系的有力手段。丹参的主要次生代谢产物可分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，其中迷迭香酸和丹酚酸B等酚酸类活性成分被认为是丹参中发挥药理活性的物质基础。Zhang等研究发现在丹参中过表达AtPAP1可显著提高迷迭香酸和丹酚酸B等酚酸类活性成分的含量；刘晓晶等人研究发现，RNA干扰木质素合成关键酶COMT的转基因丹参植株中，总木质素和木质素单体的含量均有不同程度的下降，使原本合成木质素的代谢流偏向生成酚酸类活性成分，从而使迷迭香酸和丹酚酸B的含量均有不同程度的提高。鉴于此，本研究将构建过表达AtPAP1转录因子并同时RNA干涉SmCOMT基因的表达载体并转入丹参，以期进一步提高丹参中酚酸类活性成分的含量，筛选出优异丹参株系，为丹参活性成分合成研究及分子育种奠定基础。
主要研究内容及结论如下：
1. 采用PCR及酶切技术成功构建了过表达AtPAP1转录因子并同时RNA干涉SmCOMT的重组载体PCO；通过根癌农杆菌介导法转化丹参，再经过潮霉素抗性的筛选，最终获得30株转PCO载体丹参株系；
2. 采用PCR技术检测了转PCO载体丹参株系，获得23个外源转录因子AtPAP1和SmCOMT目标片段均已稳定整合到丹参染色体上的转基因株系；采用实时荧光定量PCR技术分别检测了AtPAP1和SmCOMT在转PCO载体各丹参株系中的表达水平，结果显示：PCO-1、PCO-2、PCO-3、PCO-4、PCO-10、PCO-13、PCO-16、PCO-17、PCO-18和PCO-25等10个株系外源AtPAP1转录因子的表达显著高于对照株系，其中PCO-17株系的表达量最高，约为对照株系的286.03倍；同时除PCO-15、PCO-19和PCO-28以外的20个转PCO丹参株系SmCOMT基因的表达显著低于对照株系，其中PCO-25株系的表达量最低，约为对照株系的5.08%。
3. 采用HPLC技术检测了3月龄转PCO载体丹参株系中酚酸类活性成分的含量，结果显示：7个转PCO载体丹参株系的丹酚酸B含量均显著高于对照株系，其中PCO-17、PCO-18和PCO-25也高于仅过表达AtPAP1转录因子的丹参株系PAP1-14；7个转PCO载体丹参株系的迷迭香酸含量均高于仅过表达AtPAP1转录因子的丹参株系PAP1-14，但只有PCO-18和PCO-25显著高于对照株系。因此，在PCO-18和PCO-25株系中实现了丹酚酸B和迷迭香酸的显著上调，获得了优异的转基因丹参株系。
4. 采用组织化学染色法检测了各丹参株系成熟茎中总木质素和S型木质素的含量，结果显示二者在转PCO载体丹参株系中的含量均有不同程度的下降。采用Klason法和紫外分光光度法检测各丹参株系根中Klason木质素和酸溶性木质素的含量，结果显示：与对照株系相比，除PCO-1以外的6个转PCO载体丹参株系Klason木质素的含量均显著下降，酸溶性木质素的含量无显著差别。采用改良的thioacidolysis法检测各丹参株系根中木质素单体的组成和含量，结果显示：转PCO载体丹参株系PCO-10和PCO-25中S型木质素和G型木质素的含量均显著低于对照株系，而H型木质素的含量变化不大；同时S/G的比值和木质素单体的总量(H+G+S)也均显著下降。
5. 采用实时荧光定量PCR技术检测丹参次生代谢途径中关键酶基因的表达水平，结果显示：在PCO-25株系中，酚酸类活性成分合成的相关基因PAL、C4H、HPPR和RAS的表达量均有所上调，TAT基因的表达量无显著差别，4CL基因的表达量下调；木质素合成的关键酶基因CCR显著下调；类黄酮合成的关键酶基因F3’H和F3’5’H的表达量也发生了一定的变化，但无规律性。
相关内容
相关标签