● 摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来随着丹参需求的日益扩大，野生资源的逐渐减少，人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参现代化开发利用的必由之路。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物；另一类为脂溶性的丹参酮类物质。基于传统中药多以水煎服的用药方式，水溶性的酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质。研究报道丹参中主要的酚酸类活性成分生物主要源于酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些MYB和BHLH类转录因子的调控。鉴于此，本论文在已有研究的基础上，选取丹参MYB类转录因子PAP1为研究对象，分析其5，侧翼序列并构建了一系列删减启动子与GUS报告基因的融合载体，瞬时转化烟草，分析其在不同处理条件下的表达，为更好地研究丹参PAP1的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。 1.在NCBI上查询得到了一条SmPAP1基因的mRNA序列(序列号为GU218694.2)，利用RT-PCR和PCR的方法以丹参cDNA为模板克隆得到一个645bP具有完整开放读码框的基因，编码一个由214个氨基酸残基组成的多肽，SmPAP1具有R2R3MYB蛋白家族的保守结构域。运用Protscale、TMHMM、TargetP、NetPhos和SOPMA等生物信息学软件对该基因编码氨基酸序列进行分析，结果表明SmPAP1的分子量为 23.93kD，理论等电点为9.53，是一个不具有跨膜结构域和信号肤的亲水性细胞质蛋白，二级结构以α——螺旋为主。 2.利用PCR的方法从丹参gDNA水平克隆得到了SmPAP1基因的全长，该基因全长729bp，gDNA和cDNA序列比对结果显示该基因由2个外显子和1个内含子组成。 3.采用 DNA Walking的方法克隆得到了 1197bp的SmPAP1的5’侧翼序列。顺式作用元件分析的结果显示，该启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如MYB、Wbox、Ibox等，以及与激素响应相关的顺式作用元件ABRE、GA motif等。 4.利用实时荧光定量PCR技术对SmPAP1基因的表达模式进行了研究。SmPAP1基因在丹参的根、茎和叶中均有表达，其中叶中的表达丰度最高。低温可在一定时间范围内诱导SmPAP1基因表达上调，ABA、干旱、GA、创伤和强光光照可诱导SmPAP1基因表达下调。 5.丹参SmPAP1基因启动子——GUS报告基因融合载体转化烟草的瞬时表达结果显示，SmPAP1基因5’侧翼区在烟草中具有启动子的活性。启动子5’缺失实验证实报告基因的表达可以被强光所抑制。