题目：丹参丙二烯氧化物环化酶（SmAOC1）基因的初步研究

中药丹参是我国传统的大宗药材之一，以唇形科鼠尾草属丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎入药，具有活血调经、凉血消痈、宁心安神等功效，被广泛用于心脑血管、肝硬化、肾炎、月经不调和心烦不眠等临床疾病的治疗。丹参的主要有效成分包括脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类，其中水溶性酚酸类化合物以迷迭香酸和丹酚酸B为代表，是治疗心血管疾病的主要活性成分。近年来，随着植物功能基因组学的发展，丹参被作为药用植物次生代谢产物合成及其调控研究的理想材料，而被誉为“模式药用植物”。随着对丹参原药材需求的日益扩大，培育活性成分含量高的优良丹参新品种已成为丹参原药材生产中亟待解决的关键问题之一。相关研究表明，关键酶基因的过量表达使得目标产物合成途径上的瓶颈反应被打破，代谢流更多地往目标产物合成方向流动，从而使得目标产物过量积累。丙二烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase, AOC）为茉莉酸合成途径上的限速酶，研究其对于提高丹参的酚酸类成分的含量有重要意义。基于此，本研究在丹参中过表达AOC基因，以期此提高丹参内源茉莉酸含量，从而最终提高丹参主要酚酸类活性成分的含量。
本研究的主要内容及结论如下：
1. 利用Bio Edit软件对本实验构建的丹参转录组数据序列检索得到的丹参AOC相似序列并进行序列片段的拼接，获得1条拼接序列，经在线工具ORF finder程序预测发现，序列含有完整的开放阅读框。依据拼接序列设计特异性引物，采用RT-PCR方法，获得全长序列，将其命名为SmAOC1（GenBank：JF682783）。通过生物信息学分析得知，该基因cDNA 全长为 970 bp， 共编码 239 个氨基酸，属于不稳定蛋白。同源性分析表明，SmAOC1与已在NCBI注册的来源于其他植物的AOC基因编码的氨基酸序列具有较高同源性且与烟草NtAOC和番茄中LeAOC的相似度高达均为79%。
2. 实时荧光定量PCR分析了SmAOC1基因的组织表达模式。结果表明，SmAOC1在丹参根中表达量最高，花中的表达量相对较低，并且SmAOC1基因在外源MeJA诱导、UV处理、低温胁迫和干旱逆境处理后，该基因表达量显著上调（p<0.05）。
3. 通过PCR及限制性内切酶酶切的方法构建过表达SmAOC1的植物载体SmAOC1-1302。通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化丹参，通过抗性筛选获得8个丹参阳性转化株系，其中AOC1-2，AOC1-4和AOC1-7三个株系中SmAOC1表达量最高。
4. 为了进一步探究SmAOC1基因的表达变化对丹参酚酸类成分合成途径的影响，我们采用RT-PCR技术，对转基因株系及对照株系丹参水溶性次生代谢途径中的6个关键酶基因进行定量分析。结果显示：所检测的酚酸类合成途径的相关基因在转基因株系AOC1-2、AOC1-4及AOC1-7中均有不同程度的变化，其中PAL和TAT的上调最大，说明在代谢通路中产物的积累相对较多；而迷迭香酸合成相关基因RAS却无显著性差异。
5. 采用HPLC的方法检测30 d实生苗的阳性转基因株系酚酸类成分变化。结果显示：相对于对照株系，转基因株系中迷迭香酸无显著性差异。丹酚酸B含量显著提高，其最高含量是对照株系的1.82倍（P < 0.001）；总酚酸测定结果显示：转化SmAOC1的丹参株系的总酚酸含量高于对照株系，其中AOC1-4总酚酸含量最高为相应对照的1.46倍（P< 0.01）；内源茉莉酸含量检测结果显示：SmAOC1在转基因后的丹参植株中茉莉酸含量最高的表达株系是AOC1-4，其茉莉酸含量是对照株系的1.32倍（P < 0.01）。
通过本研究为探索高效调控丹参有效活性成分的方法，为筛选丹参有效活性成分含量显著提高的优异丹参资源，以及提高丹参活性成分的含量、分子育种及质量控制的研究奠定了基础。