● 摘要
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科（Labiatae）鼠尾草属植物，广泛分布在热带到寒带之间，具普遍逆境耐受性和生态适应性。丹参是我国传统大宗中药材之一，以干燥的根及根茎入药，在临床上用于治疗心脑血管疾病，具有活血通络、祛淤止痛、清心除烦、凉血消痈等作用。随着丹参资源的开发和利用，丹参药材的需求量日益增长。使用生物技术手段来挖掘丹参的抗逆基因并进一步研究植物抗逆机制，是筛选和培育优良丹参种质的有效策略。此外，逆境胁迫与药用植物次生代谢产物的合成有着密切关系，通过抗逆机制的研究有助于了解丹参次生代谢产物积累与环境胁迫的关系。
晚期胚胎富集蛋白基因是丹参中一类重要的抗逆基因。LEA蛋白是胚胎发育后期种子中高水平积累的一系列蛋白质，受到发育阶段、脱落酸、盐和低温等因素的调节。本研究在对丹参转录组数据库分析的基础上获得一个新的晚期胚胎富集蛋白基因（SmLEA2），通过对其进行基因克隆、表达模式研究来了解该基因的基本特征；将该基因在大肠杆菌中进行过量表达，比较重组菌与对照菌的耐盐及耐旱性；以本实验室构建的过表达SmLEA1（Genbank ID ：AY725206）基因的丹参转基因植株为材料，探讨其在胁迫处理条件下SOD活性、MDA、Vc和GSH含量等生理生化特性的变化，初步明确了SmLEA基因参与丹参抗逆和防御反应的功能。SmLEA功能的初步阐明为丹参抗逆基因的研究提供了一定的数据，也为通过基因工程手段来提高丹参抗逆性奠定了基础。主要研究结果如下：
1. 利用PCR技术从丹参cDNA以及gDNA水平克隆得到了SmLEA2基因。该基因gDNA长 1961 bp，由1个外显子和1个内含子组成，且内含子两端具有GT/AG保守序列；开放阅读框长为960 bp，共编码 319 个氨基酸。序列比对结果显示，该序列与大豆、蓖麻、拟南芥的晚期胚胎丰富蛋白有较高的相似性，推测该编码蛋白属于晚期胚胎蛋白 LEA家族成员。运用Protscale、TMHMM、TargetP、NetPhos和SOPMA等生物信息学软件对该基因编码蛋白进行序列分析，结果表明：SmLEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白，二级结构以不规则卷曲为主，无跨膜结构域和信号肽，其分子量为35.34 kD，等电点为4.77。
2. 采用DNA Walking的方法获得了约864 bp的SmLEA2 5’端侧翼序列。PlantCARE软件分析显示该调控区域含有多种顺式作用元件，包括ABRE、 TGACG-motif、CGTCA-motif、 ERE等与激素响应相关的顺式作用元件、MYB转录因子结合位点以及Box 4、CACGTGG-Box等与光诱导相关的元件等。实时荧光定量PCR分析结果显示，SmLEA2基因在植物的根、茎、叶、花和种子中均有表达。
3. 构建了SmLEA2的原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中表达了SmLEA2蛋白，获得了过表达SmLEA2蛋白的重组菌。蛋白电泳结果显示，该蛋白分子量约为39 kDa，与生物信息学预测结果相一致。在正常培养条件下，重组菌和对照菌的生长无显著差异，说明过量表达SmLEA2蛋白不会影响大肠杆菌BL21的正常生长。耐盐性分析结果表明，在含400 mM NaCl的LB固体培养基中，重组菌比对照菌的生长能力强；在添加800 mM NaCl的LB液体培养基中，重组菌比对照菌具有更短的生长迟滞期，表明SmLEA2蛋白的表达提高了大肠杆菌的耐盐能力。抗旱性分析结果表明，在添加400 mM 甘露醇的LB固体培养基上，重组菌比对照菌的生长能力有所增强；在含15% PEG的LB液体培养基中，重组菌相比对照菌提前了1 h进入对数生长期，表明了SmLEA2蛋白的表达也能够提高大肠杆菌的抗旱能力。
4. 以本实验室构建的过表达SmLEA1基因的丹参转基因植株为材料，分析了SmLEA1参与丹参抗逆反应的特性。转基因丹参、野生型和转空载丹参在MS培养基中生长状态一致，说明在正常培养条件下SmLEA1基因的过量表达对丹参生长没有显著影响。而在添加100 mM NaCl和150 mM甘露醇的MS培养基上，转基因植株的生长状态明显优于野生型和转空载植株。在NaCl胁迫下，转基因植株的SOD活性、Vc、还原型谷胱甘肽和可溶性糖的含量显著提高。在10% PEG胁迫处理后，转基因植株中MDA含量较野生型和转空载植株显著降低，受损伤程度低。
综上所述，过表达SmLEA基因能提高大肠杆菌和丹参的耐盐、抗旱性，说明SmLEA基因具有耐盐、抗旱功能，本研究为丹参抗逆机制的研究奠定了一定的基础。
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