题目：丝氨酸蛋白酶高活性菌株选育及其生防作用研究

由于耕地面积的减少和保护栽培的迅速发展，农业生产中作物连作非常普遍。作物连作时土传真菌病害和根结线虫危害常常相伴发生，使感染和危害加重。筛选和选育对植物病原真菌和根结线虫高效、对环境安全的生防菌株，采用先进的发酵工艺制备出高含菌量的生防菌剂已成为高效农业可持续发展中一项非常紧迫的任务。丝氨酸蛋白酶是一类活性中心含有丝氨酸的蛋白酶。已有研究发现，产丝氨酸蛋白酶的真菌能破坏根结线虫的体壁和卵壳，对根结线虫有较好的生防效果。芽胞杆菌对植物病原真菌的生防效果已有较多报道，但产丝氨酸蛋白酶芽胞杆菌对根结线虫的生防作用报道很少。本研究的目的是筛选产丝氨酸蛋白酶的芽胞杆菌，观察其对植物病原真菌和根结线虫的生防效果，选取酶活较高的菌株作为出发菌株，探讨其培养条件和产酶条件，通过诱变和原生质体融合技术，获得酶活提高的菌株。主要研究内容和结果如下：

（1）从豆豉、腐乳、多年连作大棚栽培的番茄根际土壤等实验材料中分离到多株蛋白酶产生菌，用丝氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA和特异性抑制剂PMSF确定产丝氨酸蛋白酶菌株，获得丝氨酸蛋白酶产生菌株SNUB18和SNUB19，PMSF对SNUB18粗酶液的抑制率为77.86%，对SNUB19粗酶液的抑制率为91.20%。依据形态特征、生理生化特性和16S rDNA比对分析对两个菌株进行鉴定，结果菌株SNUB18为黄色单胞菌(Xanthomonas campestris)，菌株SNUB19为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。由于生防菌剂要求非致病性、保存期长等特点，选择枯草芽胞杆菌SNUB19作为后续研究的实验菌株。

（2）用对峙法、抑菌圈法和液体振荡培养法观察SNUB19抗植物病原真菌的作用，发现SNUB19的发酵上清液对玉米大斑病菌PF3、番茄灰霉病菌PF4、葡萄炭疽病菌PF5和辣椒炭疽病菌PF6等植物病原真菌有显著的抑制作用，可抑制尖孢镰刀菌孢子萌发、菌丝生长。

（3）用96孔板法观察抗线虫作用，发现枯草芽胞杆菌SNUB19的无菌滤液对南方根结线虫二龄幼虫有较强的杀虫效应。

（4）采用L9(34)正交表设计实验，对枯草芽胞杆菌SNUB19的产酶培养基配方进行了优化。优化后的培养基组成为(g/L)：玉米粉40，豆饼粉 10，麸皮10，Na2HPO4 4，KH2PO4 0.30，Na2CO3 1.50。培养基优化后，酶活力为132.17U，比优化前提高58.63%。

（5）枯草芽胞杆菌SNUB19的丝氨酸蛋白酶的最适温度为40℃，高于50℃时，酶活力下降较快。酶的最适pH为8.0，在 pH7～8之间酶较稳定，pH高于8.5时酶活力下降。

（6）探讨紫外线和亚硝基胍对枯草芽胞杆菌SNUB19诱变效应，发现紫外线对枯草芽胞杆菌SNUB19进行诱变时正变率高，变异幅度大。用UV对枯草芽胞杆菌SNUB19进行诱变，最终筛选到突变株U-3-1，丝氨酸蛋白酶活为184.89U，比出发菌株SNUB19提高了29.06%。再将U-3-1用NTG诱变，筛选到突变株N-3-1，丝氨酸蛋白酶酶活力为215.78U，比U-3-1提高50.35%。

（7）用紫外线对枯草芽胞杆菌SNUB19进行诱变，以含高于致死浓度的链霉素、青霉素琼脂培养基平板进行初筛，经复筛，获得了酶活性提高且具有抗药性的突变株，其中抗青霉素突变株P-1-5，丝氨酸蛋白酶活力为174.84U，是出发菌株SNUB19的1.29；抗链霉素突变株S-2-2，丝氨酸蛋白酶活力为167.26U，比出发菌SNUB19提高23.66%。

（8）将获得的高酶活突变株N-3-1和抗药性突变株P-1-5、S-2-2经原生质体融合，筛选到酶活性提高且带有抗药性标记的融合子H-3-11，酶活力为237.67U，是出发菌株的1.65倍。经传代试验，证实融合子遗传特性稳定。

本文的创新之处在于：（1）获得了产丝氨酸蛋白酶的枯草芽胞杆菌SNUB19，证实SNUB19对植物病原真菌和根结线虫都有较好的生防作用。产丝氨酸蛋白酶枯草芽胞杆菌对根结线虫幼虫和虫卵有杀灭作用为初次发现。（2）通过诱变和原生质体融合获得了丝氨酸蛋白酶活性显著提高的突变株和融合子。

由于时间限制，本研究中多亲本原生质体融合只有一轮，如再进行多亲本递进式原生质体融合，有可能得到酶活性进一步提高的改组菌株。另外，高酶活菌株对大田作物植物病原真菌和根结线虫的生防效果也有待观察。