● 摘要
酚类化合物是葡萄酒中的重要组成成分，影响着葡萄酒的感官特征。黄烷醇以及在葡萄酒酿造过程中形成的黄烷醇聚合物是红葡萄酒中最重要的涩感物质。葡萄酒酿造工艺中有很多控制葡萄酒涩感的特殊工艺，其理论基础都是黄烷醇与蛋白质的相互作用。本文在模拟人体生理环境条件下(pH=7.4)采用荧光光谱法、圆二色光谱法和液质联用分别研究了酚类化合物与BSA的结合方式、结合位点及结合模式，酚类化合物对BSA二级结构的影响，乙醛介导酚类物质单体对BSA结构的影响，以期为二者相互作用的机理研究提供重要信息。
本研究主要获得以下结果：
1. 通过荧光光谱和圆二色光谱，研究了在模拟人体生理环境下酚类化合物单体：儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子酸（GA）、咖啡酸（CA）、槲皮素（QU）与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。得到了酚类化合物单体分别与BSA作用的结合常数、结合位点、结合模式等参数，比较了五种酚类化合物单体与BSA结合的紧密程度，讨论了酚类化合物单体对BSA二级结构的影响。结果表明：酚类化合物单体与BSA相互作用产生复合物猝灭BSA的内源荧光，其荧光猝灭机理为静态猝灭，且五种酚类化合物单体对BSA的荧光猝灭效应由大到小依次为：没食子酸＞咖啡酸＞槲皮素＞儿茶素＞表儿茶素。酚类化合物与BSA主要靠静电作用力结合。酚类化合物单体与BSA结合后，使BSA的二级结构发生了变化，其α-螺旋结构加剧，空间结构更加紧密。五种酚类化合物单体对BSA的空间结构的改变由大到小依次为：没食子酸＞咖啡酸＞槲皮素＞儿茶素＞表儿茶素，与荧光反应的结果一致。
2. 通过荧光光谱和圆二色光谱，研究了在模拟人体生理环境下黄烷醇两种单体（C和EC）共同与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，酚酸两种单体（GA和CA）共同与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。得到了两单体共同与BSA作用的结合常数、结合位点、结合模式等参数，比较了两种单体共同与BSA结合、两单体单独与BSA结合的紧密程度，讨论了两单体共同作用对BSA二级结构的影响。结果表明：C-EC的等浓度结合物与BSA结合程度大于C或EC单体等浓度与BSA的结合程度，二者共同作用于BSA时对BSA空间结构的改变大于二者单独作用于BSA。所以可得出结论：C和EC共同对BSA的作用为协同作用。酚酸间协同作用的猝灭常数Kq和结合常数KA均比黄烷醇间协同作用的猝灭常数Kq和结合常数KA大。两种酚酸间协同作用后与BSA 的结合较两种黄烷醇间协同作用后与BSA 的结合更紧密。
3. 通过荧光光谱和圆二色光谱，研究乙醛介导后酚类单体、乙醛介导后单体协同对BSA光谱的影响。通过介导后单体、介导后两种单体协同作用对BSA的圆二色光谱的改变得到BSA二级结构的变化。比较乙醛介导前后单体和单体协同作用对BSA影响的差异。结果表明：在乙醛介导下的单体对BSA 荧光曲线的降低作用不如单体自身结合BSA的曲线降低作用，说明乙醛介导对单体和BSA 的结合有减弱作用。在乙醛介导下单体协同作用对BSA的荧光猝灭程度比未引入乙醛时要强，并且在乙醛介导下，GA和CA协同作用仍然比C和EC协同作用要强。
4. 采用负离子检测模式的LC-MS技术，研究了酚类化合物单体(C、EC、GA、CA、QU)与乙醛反应后的结构与分子量变化，分析了该类化合物与乙醛反应的结构变化规律，建立了快速分析酚类化合物的质谱分析方法。结果表明：新复合物的紫外可见光谱的扫描范围250~500nm，与单体的最大吸收波长在280nm附近，都表明了原始的结构依然保留。儿茶素与乙醛反应后生成了5种复合物，表儿茶素与乙醛反应后生成了3种复合物，槲皮素与乙醛反应后生成了2种复合物。新生成的二聚体片段的出峰位置在单体峰之后，说明该物质的极性较单体小或羟基较少。在质谱图上有明显的分子离子峰[M-H]m/z285。另外在+M+－1=606的选择离子图上可以看到响应峰，说明各二聚体的结构为单体-乙烷基二聚体的同分异构体。
5. 通过荧光光谱和圆二色光谱，研究乙醛介导后佳美葡萄酒中的单体酚、梅鹿辄葡萄酒中的低聚酚类和赤霞珠葡萄酒中的高聚酚类对BSA光谱的影响。结果表明：在乙醛浓度为0~1000μL时，不同聚合度酒样对BSA的荧光发射峰的降低范围由小到大依次为：佳美单体酚、梅鹿辄低聚、赤霞珠高聚。赤霞珠高聚、梅鹿辄低聚、佳美单体酚对BSA的α-螺旋结构的加剧依次减弱。也说明葡萄酒中的酚类物质聚合度越高，与蛋白质结合的能力越强。