题目：红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建

天然小分子药物一直是人类抵御疾病的重要手段，抗生素的发现及其使用，拯救了成千上万人的生命，但是大量抗性致病菌如耐万古霉素、甲氧西林抗性等“超级细菌”的出现，极大地威胁着人类生命健康。因此，如何建立组合性生物合成平台，更加有效地利用现有天然小分子资源，开发新的抗生素，意义重大。
聚酮是来源于放线菌等的一大类结构复杂、活性多样、临床应用广泛的化合物。负责聚酮合成的模块性聚酮合成酶（polyketide synthase, PKS）的多个基因成簇排列、活性位点的排列顺序与聚酮分子的合成步骤、产物结构间具有一一对应关系，特别适合利用基因工程等手段，进行组合性改造。红霉素是一种典型的模块类聚酮抗生素，对红霉素结构的改造和修饰最有可能产生新型抗生素。目前，红霉素生物合成的分子生物学机制已经阐明，参与其合成的基因大多被证明可在大肠杆菌中功能性表达，已成功实现PKS在大肠杆菌中的重建，获得了6-脱氧红霉内酯B（6-deoxyerythronolide B, 6dEB）及其衍生物。此外，有关6dEB后修饰的研究也有了突破性进展。为了更好的将基因工程的相关技术应用于新型红霉素的研发，建立一个稳定的、高效的红霉素组合合成平台显得尤为重要。
本课题采用组合生物合成的理念，借鉴已有的研究成果，在大肠杆菌中进行红霉素合成通路的重建。红霉素合成包括聚酮化合物的合成及其糖基化修饰等，整个通路涉及众多基因，反应多样，有些蛋白还需要进行翻译后修饰。首先，选择基因组中整合有枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因sfp的BAP1大肠杆菌作为表达宿主，以实现聚酮合成酶中酰基运载蛋白ACP的翻译后修饰。其次，为方便众多基因的克隆与组装，利用重叠PCR技术，通过对常用表达载体pET-22b和pET-28a的定点突变，构建了新型的多基因串联共表达载体pET-m22b和pET-m28a，为多基因的组装提供重要载体系统。然后，将整个合成通路人为分成6dEB合成和6dEB后修饰两部分。6dEB合成通路中，糖多孢红霉菌的基因eryAI、eryAII、eryAIII可表达聚酮合成酶模块、实现碳链的延伸和环化；天蓝色链霉菌的丙酰-CoA羧化酶基因accA1、pccB则能保障6dEB合成前体的供给； 6dEB后修饰通路中，主要进行糖基化修饰，需要克隆糖多饱红霉菌的糖基化基因eryBII、eryBIV、eryCII、eryCIII、eryBVI、eryBV；弗氏链霉菌的的糖基化基因tylAI、tylCIII、tylCVII；委内瑞拉链霉的糖基化基因desI、desII、desIV、desV、desVI等；此外，为了促进合成通路相关基因在大肠杆菌中的正确折叠，需要克隆分子伴侣基因groEL和groES。根据上述设计，最终为了实现复杂红霉素合成重建，研究中首先克隆了参与红霉素生物合成的通路的所有22个基因；应用多基因串联共表达载体完成了相关基因的串联组合，分别构建了多基因重组质粒pBJ144、pBJ130、pBJEM和pBJDE，成功实现6dEB合成通路和6dEB后修饰通路的重建；重组质粒转化后诱导表达，SDS-PAGE检测表明单个基因均能正常表达，共表达时大部分基因仍有明显的表达，个别基因表达不明显；将6dEB合成通路BAP1（pBJ144/pBJ130）进行低温诱导发酵，添加丙酸钠作底物，产物粗提后质谱检测到6dEB，产量约10 mg/L；将6dEB后修饰通路BL21（pBJEM/pBJDE）进行低温诱导发酵，以6dEB作为底物，未能检测到相应的产物，可能需要对基因的表达做适当的调节。本研究的进一步深入，将最终实现红霉素合成通路在大肠杆菌中的完整重建，为开发新型红霉素及红霉素衍生物建立稳定的研究平台，为聚酮类抗生素的组合性生物合成等奠定了良好的基础。