题目：茶树CsAG基因克隆及AG基因系统进化分析

摘 要
茶树(Camllia sinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科山茶属，是雌雄同株异花授粉的常绿叶用灌木或小乔木，为多年生喜温喜湿畏寒植物，是我国重要的木本经济作物之一。茶树全年的生长由营养生长和生殖生长组成，茶树从当年花芽分化开始到翌年果实成熟需经历约一年半的时间，这无疑会争夺大量营养物质，对茶树芽叶的生长发育造成不必要的竞争，进而影响茶树鲜叶的产量以及芽叶品质，导致商品茶经济效益下降。
长期以来，为了提高茶树鲜叶的产量和茶叶的营养品质，多采用合理修剪、适当遮荫、施用氮素比例高的复合肥，或结合外源激素和成花抑制剂的喷施等措施抑制生殖生长。但如何合理调控茶树的生殖生长和营养生长，从根本上提高茶树产量和茶叶品质，是茶树研究工作者亟待解决的问题。AGAMOUS基因是植物花发育模型中的C类基因，在调控植物花器官分化和发育中具有重要功能。因此，从茶树中克隆AGAMOUS基因，阐明其在转录水平对茶树雄、雌蕊发育的调控机制，并从基因结构和蛋白产物的理化特性探讨基因功能，将为今后利用生物技术手段控制茶树的生殖生长提供重要的理论依据。
本研究以陕西地方茶树种质‘紫阳槠叶种’为实验材料，通过改良的SDS酸酚法提取茶树总RNA；采用RT-PCR和RACE相结合的方法同源克隆获得茶树CsAG基因cDNA序列全长；半定量RT-PCR检测CsAG基因在茶树各组织中的表达量，并对茶树CsAG蛋白进行结构功能及AG基因系统进化的生物信息学分析。研究结果如下：
1. 采用改良的SDS酸酚法提取茶树不同组织总RNA，结合RT-PCR同源扩增和RACE技术相结合的方法，克隆得到了茶树AGAMOUS同源基因的CDS，序列全长1263bp，5′ -UTR长度为208 bp，3′-UTR为315bp，编码阅读框长度为738bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。同源性比对结果显示，该序列与多种植物AGAMOUS同源基因具有较高同源性，与山茶花AG基因同源性高达90%，故将其命名为茶树CsAG基因 (GenBank 登录号：KJ630566)。
2. 半定量RT-PCR结果表明CsAG基因在分化完成的茶树花芽的和盛花期的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊以及茶树幼果和芽叶中都有表达，但各组织中的表达程度不同：在雄蕊、雌蕊中表达最强，其次是花芽、萼片及果实，在花瓣中的表达较弱，在芽叶中检测不到CsAG基因的表达，表明CsAG是参与茶树花发育的功能基因。
3. CsAG基因的结构功能预测显示：茶树CsAG基因编码一个长度为254个氨基酸残基的序列，包括有60个氨基酸残基的MADS-box域和100个氨基酸残基的K-box域，是典型的MIKC型MADS-box家族基因。预测蛋白质分子式为C1216H1972N370O383S11，相对分子量为28255.9，等电点PI为9.38，不稳定蛋白质参数为56.76，为一个亲水性且不稳定的蛋白质，磷酸位点预测显示该蛋白有多个磷酸位点，其中色氨酸(Ser)13个，络氨酸(Tyr)位点3个。蛋白质的结构预测结果显示CsAG蛋白由α-螺旋(100aa, 40.82%)、延伸链(23aa, 9.03%)和无规卷曲(122aa, 49.80%)构成，具有与其他植物如烟草、葡萄、山茶花等AG蛋白相似的三级结构。
4. 对茶树CsAG基因的序列多重比对结果表明：CsAG基因与其它植物AG同源基因都有该基因家族特有的AG motif I和AG motif II两个保守区域，表明CsAG为MADS-box家族的AG家族成员；构建CsAG基因系统进化树发现，茶树CsAG基因被准确归类到C类基因家族，其中CsAG基因与山茶花的AG1相似性最高，说明茶树CsAG基因与山茶花的亲缘性最近，其次为野豌豆和八仙花。