题目：人工合成的抗蚜基因（ASGNA）在拟南芥中的表达及抗蚜性分析研究

 棉花作为主要的纺织工业原料，具有重要的经济价值。但是棉花植株易受病虫害的危害，影响产量和品质，造成经济损失。蚜虫是危害棉花的重要害虫之一，近年来随着水肥条件的改善和农业生态环境的变化，棉花受蚜虫的危害日趋加重。长期以来，棉蚜的防治主要依靠化学农药，由于化学农药的大量使用，导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧。因此，培育具有高效抗虫特性的优质棉花一直是育种学家追求的目标之一。
随着分子生物学及重组DNA技术的迅速发展，利用基因工程技术将外源杀虫基因导入棉花以获得转基因抗虫棉已成为解决棉花虫害的手段之一。雪花莲凝集素(Galanthus navalis agglutinin，GNA)来源于石蒜科雪花莲的植物凝集素，对刺吸式口器的同翅目害虫（如稻飞虱，蚜虫等）具有较好的抗性，可以有效抑制害虫的生长和繁殖，并且对人畜及蚜虫的天敌无害，因此在转基因抗虫棉研究中具有良好的应用前景。
本课题电子克隆雪花莲凝集素（GNA）基因，对其密码子进行优化、改造，通过over-lap PCR在实验室人工合成了适合在双子叶植物中表达的新型雪花莲凝集素基因（ASGNA），将该基因分别与组成型35S启动子和我们实验室前期克隆的诱导型D-7启动子相连构建了表达载体，通过农杆菌介导的真空转化法将两个表达载体35S-ASGNA，D7-ASGNA分别导入拟南芥中，经筛选后获得纯系植株。进一步对转基因拟南芥进行分子检测及抗蚜性分析，以确定改造的ASGNA基因的抗蚜效果。在此基础上探索了利用花粉管通道法将新型抗蚜基因ASGNA导入棉花中，为今后培育具抗虫特性的优质棉花奠定基础。
　　本实验结果如下：
1、电子克隆获得雪花莲凝集素基因LECGNA2（基因序列号为GenBank: M55556.1）序列，在不改变氨基酸序列的前提下，将LEC GNA2的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，使其更适合在双子叶植物中表达，将得到新型雪花莲凝集素基因命名为ASGNA。
2、通过over-lap PCR人工合成了经密码子优化的新型雪花莲凝集素基因（ASGNA）。该基因全长512bp，其特征在于包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp的开放读码框，编码157个氨基酸。
3、利用pGEM-T easy、pEASYTM-T5 Zero、pKannibal和pART27载体，成功构建了由组成型CaMV35S启动子和诱导型D-7启动子驱动ASGNA基因的植物表达载体，分别命名为35S-ASGNA和D7-ASGNA。
    4、 将构建好的植物表达载体35S-ASGNA和D7-ASGNA通过农杆菌介导的真空转化法转化野生型拟南芥，收获种子后，在无菌条件下卡那霉素筛选后获得转基因拟南芥植株。
5、在DNA和RNA水平上对转基因拟南芥纯系植株进行分子鉴定，结果显示在DNA和RNA水平上均有ASGNA的表达，证明外源ASGNA基因已经成功转入拟南芥中。
 6、对转35S-ASGNA的拟南芥植株进行蚜虫抑制率、蚜虫逃逸、母蚜产子率实验，结果显示转35S-ASGNA的5个拟南芥株系均有不同程度的抑蚜效果，蚜口密度抑制率从12%-75%不等，对蚜虫的平均抑制率为44%；此外，蚜虫对转ASGNA基因拟南芥的趋避效应高于野生型拟南芥，上述实验结果表明转ASGNA基因的拟南芥对蚜虫有抗性；转基因拟南芥较野生拟南芥能使蚜虫的繁殖率降低，蚜口密度减少。综合蚜虫在转基因拟南芥与野生拟南芥的趋避效应和繁殖能力实验，说明转基因拟南芥对蚜虫有一定的抑制作用。
7、探索了利用花粉管通道法将人工合成的抗蚜基因（ASGNA）导入棉花的方法。