● 摘要
萜类化合物在植物生长、发育以及次生代谢物的合成中发挥着重要的作用；许多萜类化合物具有良好的药理活性，在医药卫生和工农业生产中被广泛应用，如红豆杉中的紫杉醇、青蒿中的青蒿素和丹参中的丹参酮类化合物等。因此，对于萜类化合物合成途径中关键酶以及编码关键酶的基因研究就显得尤为重要。植物萜类化合物的合成途径主要分为三个阶段，第一阶段是中间体异戊烯基焦磷酸 (IPP) 和其双键异构体二甲烯丙基焦磷酸酯 (DMAPP) 的合成；第二阶段是直接前体物质的合成，包括牻牛儿基焦磷酸 (GPP) 、法呢基焦磷酸 (FPP) 和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (GGPP) ；第三阶段是萜烯生成阶段。本研究利用生物信息学手段，对不同物种中植物萜类代谢途径第一阶段和第二阶段关键酶及相关基因 (基因家族) 进行系统分析，包括核酸和蛋白序列分析、蛋白功能结构域分析、蛋白基本性质和高级结构预测分析、分子系统发育分析等，旨在找到植物萜类代谢途径关键酶相关基因 (基因家族) 的保守与变化式样；重点阐述植物萜类代谢途径关键酶的共性和特性，希望对后续研究萜类代谢途径关键酶基因功能提供有用的参考信息。此外，丹参脂溶性有效成分亦为萜类化合物，对其萜类合成途径关键酶的研究尤为重要，本研究还通过RT-PCR对丹参中HMGR和DXS两个基因家族进行了表达模式分析。具体研究结果如下：
1. 植物萜类合成途径第一阶段有四种关键酶，分别为：HMGR、DXS、DXR和IPI。HMGR蛋白为亲水性蛋白，在肽链150位氨基酸残基前有两个明显的疏水区，与跨膜结构分析结果相一致，即植物HMGR蛋白N端存在两个跨膜结构；植物HMGR有的不存在信号肽，以此推断，植物HMGR在游离核糖体上合成后，不进行蛋白质转运，在细胞质中直接参与相关生化反应。部分蛋白质含有转运肽，与MVA途径发生于细胞质中不相符，还需对预测结果进行进一步的实验证实。其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；HMGR序列中四个功能域高度保守，但在橡胶HMGR1中NADPH结合域缺失，可能与功能相关。
DXS蛋白属亲水性蛋白，没有明显的疏水结构，相应的亦没有跨膜结构；DXS蛋白含有叶绿体转运肽，推断其在细胞质中合成后，被转运至叶绿体中参与相关反应，这一结果与MEP途径仅发生在质体中吻合；植物DXS蛋白的二级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲构成，两者比例相近；多序列比对发现，其肽链N端不保守，推测其变化是由转运肽的不保守性引起的；结合分子进化树发现DXS蛋白被分为3类，DXS1、DXS2分别聚为一支，拟南芥DXS3和玉米DXS3为第三支，这三支在保守区TPP结合区以及嘧啶结合区是保守的，但每一类之间仍存在差别，特别是拟南芥DXS3和玉米DXS3与其他两支在保守区差别较大。
DXR蛋白同样为亲水蛋白，没有明显的疏水性结构，也不存在跨膜结构；在所选蛋白中除烟草、长春花和甜叶菊中的DXR外，其他的均具有叶绿体转运肽，推测它们在细胞质中合成后，被转运至叶绿体中参与相关反应，烟草、长春花和甜叶菊中的DXR不含有转运肽，还需进一步实验验证；DXR蛋白的二级结构同样主要由α-螺旋和不规则卷曲构成，两者比例相近；DXR蛋白的多序列比对，在五个功能保守区高度保守，主要差别仍出现在肽链N端，由转运肽的不保守性引起。DXR分子系统进化树基本符合植物分类学，裸子植物和被子植物被分为两个大类。
IPI蛋白不含跨膜区域；植物 IPI在叶绿体和细胞质中均有存在；植物IPI蛋白的二级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲构成；IPI蛋白序列高度保守；不保守区出现在其N端，结合转运肽结果分析可得，含有转运肽的物种，其IPI蛋白序列长于不含有转运肽的物种，且转运肽区不保守，可能与识别特异性相关，而与二级结构无太大关系。分子进化树分析反映了不同植物间IPI的亲缘关系，虽与自然进化不尽相同，但对判断不同物种间的亲缘关系有一定的借鉴意义。
2. 植物萜类合成途径第二阶段包括三种酶，分别为GPPS、FPS和GGPPS，都属于短链异戊烯基转移酶。这三种酶均属于亲水性蛋白，没有明显的疏水区域，与三者都没有跨膜结构相对应。通过转运肽分析发现，三种蛋白在细胞中的分布多样，说明其在细胞中广泛参与植物次生代谢物的生物合成。三种蛋白的二级结构均以α-螺旋为主要结构，不规则卷曲、延伸链和β-转角分布于整个肽链结构中。短链异戊烯基转移酶均含有两个天冬氨酸富含区(DDXXD)，通过多序列比对结果可知，FPS和GGPPS的两个天冬氨酸富含区具有高度保守性，而这两个区域在GPPS中的保守性较差。对FPS蛋白进行多序列比对后发现，拟南芥FPS1和银杏FPS在其N端不保守，结合转运肽分析结果，可知不保守区为转运肽区域。GGPPS多序列比对结果同样为N端不保守，其不保守性同样与转运肽相关。分子进化树的分类结果与生物系统进化并非一致，但可为不同物种间的亲缘关系判断提供一定的参考。
3. 通过RT-PCR检测丹参HMGR和DXS基因mRNA水平表达情况。结果显示，丹参根中HMGR1的表达量最高，且HMGR1在根中的表达量与HMGR2和HMGR3有显著性差异；叶和茎中HMGR2的表达量最高，HMGR2的表达量与HMGR1和HMGR3有显著性差异，推测，HMGR1在丹参根中萜类化合物的合成中具有重要作用。在丹参DXS家族中，丹参根和叶中DXS2的表达量最高，茎中DXS1的表达量最高，且与其他成员的表达量有显著性差异，推测DXS2在丹参中萜类化合物的合成中起到重要作用。
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