题目：转ASGNA拟南芥鉴定、抗虫性分析和对棉花的遗传转化

棉花是世界上重要的经济作物，在纺织工业中担任重要的角色。但棉花易遭受各种病虫害的侵染、咬噬，因此抗虫棉的培育已引起了各国普遍的关注。我国常见的抗虫棉主要是针对抗棉铃虫的转基因棉，而近年来，吸食汁液的昆虫，如：蚜虫 (Aphis gossypii)，小叶蝉(Amrasca devastans)，粉虱(Bemisia tabaci)，盲椿象(Pantatomidae)，已成为了棉铃虫之后的又一类棉花主要的害虫，因此培育抗吸食汁液害虫的棉花有重要意义，而基因工程技术的发展为培育新型抗虫棉提供了有效的技术手段。本课题利用本实验室前期人工合成的一个新的ASGNA（arttifical synithsised Galanthus navalis agglutinin），作为抗虫基因，通过转基因拟南芥及瞬时表达技术检测了该基因的抗虫性，在此基础上，通过基因工程技术转入棉花中，以期培育新的抗蚜虫的转基因棉花。具体实验结果如下：

    1）对本课题组前期培育的5个转ASGNA基因的拟南芥株系，经抗性筛选获得纯系植株；通过转录水平及蛋白表达检测，表明5个转基因株系都有ASGNA的表达，在根、茎、叶、花中表达量平均为528.29-675.84 ng/100 g鲜重。

2）对5个转ASGNA株系进行抗虫性分析，结果显示转基因植株对蚜虫的存活率，产子率以及生长发育均有影响。与对照组相比，转基因拟南芥上的蚜虫存活率下降55.0 %-80.70 %，产仔率下降67.50 %-82.50 %；蚜虫体宽减少0.20-0.36 mm，蚜虫逃逸数量也显著高于野生型拟南芥。上述结果显示ASGNA对蚜虫有较好的抗性。

3）对5个转ASGNA株系进行抗小菜蛾(Plutella xyllostella )分析，与对照组相比，转基因拟南芥上的小菜蛾存活率无明显差异，但是转基因拟南芥上生长的小菜蛾平均体重每只减少8.84 mg ；结茧率也低于对照组；另外观察到转基因拟南芥上生长的小菜蛾有少数不吐丝直接化蛹现象。表明ASGNA对咀嚼式害虫也有一定抗性。

4）构建了瞬时表达载体：35s-ASGNA-eGFP-pBI121和35s-ASGNA-pART27，分别转入农杆菌LBA4404中，利用棉花子叶瞬时表达系统进行瞬时表达ASGNA-eGFP融合蛋白和，通过RNA水平检测ASGNA和eGFP及观察绿色荧光；表达ASGNA蛋白，进行RNA水平检测。表明棉花子叶瞬时表达系统可在转录水平及蛋白水平表达ASGNA 基因。

5）利用上述瞬时表达系统进行抗虫性分析，以饲喂转空载体的同期生长的棉花子叶为对照，瞬时表达ASGNA的棉花子叶叶片上，蚜虫存活率下降45.0 %-52.5 %，产仔率下降68.5 %-82.5 %，而蚜虫逃逸数量高于对照组。上述实验数据表明，棉花子叶瞬时表达的ASGNA蛋白具有较好的抗蚜虫效果。

6）构建转ASGNA基因棉花表达载体35S-ASGNA- pART27，通过农杆菌侵染棉花下胚轴再生愈伤组织的方法，将其转入棉花细胞，经棉花植物组织培养，Kana抗性筛选，多次继代培养后，获得T0代转基因棉花，经初步分子鉴定，为转ASGNA的棉花植株。