● 摘要
人体蛋白一旦发生淀粉样变性，容易诱发多种神经退行性疾病，如阿兹海默病、帕金森病、疯牛病、家族性血管淀粉样变性病、溶菌酶淀粉样变性病等等。所谓淀粉样变性主要是指蛋白质出现错误折叠或者部分降解，最终形成了不溶于血浆的淀粉样纤维。它们能对人体泌尿、神经、心血管等系统造成损害，引发多种疾病。也有研究表明，与疾病不相关的蛋白质如胰岛素，在一定的条件下也能转化成淀粉样纤维。可见，淀粉样纤维化是所有蛋白质的共性。蛋白质的淀粉样纤维化过程是一个成核依赖过程。在这一过程中，蛋白单体首先组合成具有部分折叠结构的中间体，再转化为成核寡聚体。成核寡聚体进一步生长成为原纤维，原纤维通过彼此间相互聚集最终形成大分子的成熟纤维。
本文以牛胰岛素（Bovine Insulin, 简称BI）和鸡蛋清溶菌酶（Lysozyme，简称LYS）为体外研究模型，探索酚类物质及纤维种子在蛋白质淀粉样纤维化过程中产生的影响，以及它们的作用机理。主要过程包括：从酚类物质中筛选抑制剂；从是否形成共价键，是否转化为醌式结构的角度探究抑制剂的作用机理；研究纤维种子对淀粉样纤维化过程的影响；分析纤维种子促进作用的原理；探究不同抑制剂存在下纤维种子能否发挥促进作用。
主要实验方法和结果：
1.牛胰岛素、溶菌酶淀粉样生长检测
采用ThT（硫黄素T，Thioflavine T）荧光分析、ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸，8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid）荧光分析、透射电子显微镜（TEM）技术检测牛胰岛素和溶菌酶在淀粉样纤维化进程中荧光强度和形态的改变。ThT能与蛋白中的β-折叠特异性结合，反映蛋白质淀粉样纤维化过程中β-折叠结构的变化情况。ANS能够与蛋白质疏水区域进行特异性结合，反映出纤维化过程中疏水区的暴露情况。结果表明，牛胰岛素和溶菌酶的纤维化过程中都伴随着β-折叠结构的不断增加和疏水区的逐渐暴露，其ThT生长曲线均呈“S”型外观，经历成核、生长、成熟三个动力学阶段。在透射电镜下孵育3天的牛胰岛素外形呈球形小颗粒状，孵育4天的牛胰岛素呈现出稀疏、有分支的短链，孵育7天的牛胰岛素和孵育12天的溶菌酶均为外观粗壮、密集、无分支的直径约5到35nm的长链。
2.EGCG对蛋白质纤维化过程和成熟纤维的影响及机理探究
通过ThT荧光分析筛选出同浓度的四种茶多酚中EGCG（表没食子儿茶精-3-五倍子酸，Epigallocatechin Gallate）对蛋白质的淀粉样纤维化过程的抑制作用最强，同时EGCG还对成熟的淀粉样纤维有破坏作用。通过MALDI-TOF质谱分析发现被EGCG作用的样品分子离子峰的质荷比大于纯牛胰岛素，其差值刚好为EGCG的相对分子质量减去一个氢原子的相对原子质量。表明EGCG与牛胰岛素发生了共价结合。将EGCG修饰后的蛋白进行电泳、电转分析，并配合巯基试剂DTT（二硫苏糖醇，Dithiothreitol）、NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-Ethylmaleimide）的运用，判断修饰在蛋白上的EGCG的形态及作用位点。结果表明EGCG是以蛋白上的巯基为作用位点对蛋白进行修饰，同时EGCG自身转化为了醌式结构。
3.常见酚类物质和对苯醌对蛋白质纤维化过程的影响及机理探究
采用ThT荧光分析、ANS荧光分析确定了邻苯二酚、对苯二酚、对苯醌对蛋白质淀粉样纤维化过程能起到抑制作用。通过电转分析发现邻苯二酚、对苯二酚、对苯醌在碱性条件下能被NBT染成紫色，说明邻苯二酚和对苯二酚都已转换为了相应的醌类物质。四种常见的酚类物质中只有邻苯二酚和对苯二酚因其特殊结构能够进一步转化为邻苯醌和对苯醌。而多酚类物质只有转化成了醌类物质才能对蛋白质的淀粉样纤维化过程产生抑制。
4.纤维种子对蛋白质纤维化过程的影响
把孵育成熟的淀粉样纤维，在37℃的条件下进行超声，使纤维被彻底打碎，打碎后的纤维即可作为纤维种子加入其他样品中进行孵育。实验证明，纤维种子类似于纤维化过程中的原纤维状态，其余蛋白质可迅速在原纤维的基础上聚集、生长，在极短的时间内，长成成熟的纤维。把纤维化中、后期的蛋白样品在37℃的条件下进行超声破碎，加入未孵育的蛋白中，仍然可以起到纤维种子的作用，加速蛋白质的淀粉样纤维化。不过纤维种子对蛋白质纤维化的促进能力与纤维种子自身的纤维化程度有关。纤维种子的纤维化程度越高，促进作用越明显。
5.纤维种子和EGCG对蛋白质纤维化过程的影响
在牛胰岛素中同时加入EGCG和纤维种子进行孵育，通过ThT荧光分析发现，在0-2天时，同时加入EGCG和纤维种子的样品荧光强度高于纯牛胰岛素样品和只加入EGCG的样品，但明显小于只加入纤维种子的样品。从第3天开始，同时加入EGCG和纤维种子的样品荧光强度逐渐降低，在第7天时和只加入EGCG的样品荧光强度几乎相同。通过透射电子显微镜分析发现纤维种子和EGCG共存的样品在第7天时牛胰岛素并未形成完整的纤维，仍为稀疏的短链，不过比只加入EGCG的样品形成的纤维稍粗壮一些。故在纤维生长的前期纤维种子和EGCG共同发挥了作用，纤维生长的中后期主要是EGCG发挥其抑制作用。由于EGCG对蛋白的破坏作用是不可逆的，在EGCG存在的条件下即使加入纤维种子，最终也难以形成成熟的纤维。
6. PEG对蛋白质纤维化过程的影响
PEG（聚乙二醇，Polyethylene Glycol）在溶液中能形成一种拥挤的环境，其浓度越大，对蛋白起到的分散作用就越明显。蛋白间的相互聚集受到阻碍而难以形成纤维，故PEG对蛋白质纤维化过程能起到一定的抑制作用。PEG作用后的样品在任意时刻加入纤维种子，ThT荧光强度立刻增强。这是由于PEG只能把蛋白质的纤维化抑制在原纤维阶段，一旦加入纤维种子，蛋白就能在纤维种子的表面聚集、生长，迅速长成成熟的纤维。
结论：综合实验结果可知，牛胰岛素和溶菌酶在一定的条件下均能形成淀粉样纤维，其生长曲线均呈“S”形。EGCG、邻苯二酚和对苯二酚能抑制蛋白质淀粉样纤维化过程，破坏成熟的淀粉样纤维，其机理都是酚类物质转化为相应的醌式结构与蛋白质的巯基发生了共价结合。纤维种子的存在能大大加速蛋白质淀粉样纤维化进程。当纤维种子与EGCG同时存在时，纤维生长的前期EGCG和纤维种子共同发挥作用，纤维生长的中后期，则主要为EGCG发挥其抑制作用。PEG能在体系中营造一种拥挤的环境，将蛋白的浓度分散，使蛋白与蛋白间无法聚集。然而PEG只能把蛋白质的淀粉样纤维化抑制在其原纤维的阶段，在含PEG的体系中一旦加入纤维种子，蛋白就能在纤维种子的表面聚集、生长，迅速长成成熟的纤维。