● 摘要
蛋白质是一类重要的大分子，在生物体内占有特殊的地位，是一切生命的物质基础，在人体的生命活动中起着很重要的作用。迄今为止，已经确认有二十多种人类疾病与蛋白质或者多肽淀粉样纤维化有关，如Alzheimer’s疾病、帕金森病、疯牛病、2型糖尿病等等。还有一些实验研究表明，在低pH、加热、搅拌、加入助溶剂或者变性剂等特定条件下，某些与疾病不相关的多肽和蛋白质(如溶菌酶、胰岛素等)，同样能够自组装形成纤维结构，表现出淀粉样纤维之特性，所以我们得出淀粉样纤维化是大多数蛋白质的共性。蛋白质发生淀粉样沉积，造成心血管系统、神经系统以及泌尿系统损害，引发各种疾病。因此蛋白质淀粉样纤维化分子机制及其相关疾病的治疗已成为目前的重要科学问题之一。
蛋白质淀粉样纤维化是一个复杂的过程，单体经自组装形成一系列大小形状不同的中间体，如寡聚体﹑原纤维，最终形成纤维。通常情况下，淀粉样纤维会聚集在各种器官或组织的细胞膜上，引发细胞或组织功能性障碍，从而导致相关病症的发生。目前对淀粉样纤维化的形成机理、淀粉样纤维的有毒成分和致病机制仍不是很清楚，特别是在分子水平和蛋白质结构上的研究方面，进一步的探索是十分必要的。
本文选用了牛胰岛素蛋白为研究对象，探索巯基化合物在淀粉样纤维化过程中的作用。第一部分，通过对比半胱氨酸(CYS)﹑还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)、L-胱氨酸对牛胰岛素淀粉样纤维化的作用，发现CYS﹑GSH、DTT对纤维化过程的抑制作用是分子中的巯基起作用；第二部分，探索巯基化合物在牛胰岛素淀粉样纤维化过程中抑制作用的分子机理。
实验主要方法和结果：
1.牛胰岛素纤维生长的检测：
通过蛋白荧光标记技术[ThT( Thioflavin T)、ANS(1-anilino- naphthalene 8-sulfonate)]荧光标记)和圆二色谱技术检测牛胰岛素纤维的生长动力学。结果表明，牛胰岛素在纤维化过程中主要伴随着a-螺旋减少，同时β-折叠增加，疏水区域逐渐暴露，其纤维生长曲线呈“s”型，具有成核-延伸-形成纤维的动力学特征。
2.不同化合物对牛胰岛素纤维化的影响
采用荧光探针技术和圆二色谱检测不同物质CYS﹑GSH、DTT、GSSG和L-胱氨酸对牛胰岛素淀粉样纤维化过程中的影响和构象变化。加入CYS﹑GSH、DTT荧光强度几乎没有变化，即这三种化合物对牛胰岛素淀粉样纤维的形成起抑制作用；GSSG和L-胱氨酸对牛胰岛素淀粉样纤维的形成具有促进作用。
在透射电子显微镜下，成熟的牛胰岛素纤维呈密集的细线网状结构，无分支，粗细比较均匀。加入GSSG和L-胱氨酸的牛胰岛素呈现成熟纤维形态，与纯胰岛素成熟纤维的形态相似。而加入CYS、GSH、DTT的牛胰岛素样品，聚集体呈小蠕虫状，视野内几乎看不到成熟纤维，表明巯基化合物能够抑制牛胰岛素淀粉样纤维化。
通过DTNB和Tricine SDS-PAGE实验说明，牛胰岛素蛋白在淀粉样纤维化过程中链间二硫键保持完整，加入巯基小分子化合物(CYS、GSH、DTT)后，随着孵育时间的增加，牛胰岛素单体蛋白含量逐渐降低，单体蛋白下方出现小分子的水解片段。利用MALDI-TOF-MS检测，发现小分子片段为B链，说明在巯基小分子化合物的的作用下，牛胰岛素蛋白在纤维化过程中链间二硫键产生断裂。
3.巯基化合物与牛胰岛素纤维相互作用的机理分析
通过向牛胰岛素淀粉样纤维化过程的不同时期加入CYS、GSH、DTT，分别进行ThT荧光、DTNB测定自由巯基含量、Tricine SDS-PAGE电泳以及MALDI-TOF-MS分析检测，以此探索巯基化合物对牛胰岛素淀粉样纤维化抑制作用机理。实验结果表明，在牛胰岛素纤维化过程中，巯基化合物抑制作用体现在纤维生长的初期，自由巯基诱导牛胰岛素蛋白分子间的二硫键发生断裂，-SH和S-S发生交换反应，改变了纤维聚集的方式，进而抑制纤维生长。
结论：牛胰岛素在本文的实验条件下可以形成淀粉样纤维，在纤维化过程中，伴随着α螺旋结构减少，β-折叠结构增加，以及疏水区域外露。含巯基的小分子化合物，如CYS、GSH和DTT对牛胰岛素淀粉样纤维的形成具有抑制作用。在巯基化合物存在下，牛胰岛素蛋白不能形成典型的纤维结构，巯基化合物通过与牛胰岛素蛋白分子的二硫键发生相互作用，抑制了其分子的自组装方式和纤维化进程。