● 摘要
溶血栓是临床治疗血栓性疾病的首选方案，临床常用的溶栓制剂主要包括纤溶酶或者纤溶酶原激活剂类药物。但是，由于人体来源的纤溶酶含量及来源非常有限，并且价格昂贵，限制了临床上的大规模使用。随着血栓性疾病患者的日益增多，对于溶栓药物的需求急剧增大，开发非人源纤溶酶已经成为当今生物医药研究的热点。蛇毒中含有丰富的丝氨酸蛋白酶，能作用于哺乳动物血液循环系统的不同环节，干扰人体凝血-纤溶稳态，而纤溶酶便是丝氨酸蛋白酶家族中的一亚类，能特异性的水解纤维蛋白，在血栓性疾病的临床治疗中具有潜在的利用价值。本课题拟以中介蝮粗蛇毒为材料，采用色谱层析技术从中分离纯化出具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，并对其生物活性进行了表征，主要的实验内容和结果如下：
1. 中介蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化
（1）凝胶过滤层析分离：中介蝮粗毒首先经凝胶过滤层析技术（Sephacryl-200HR）初步分离，用50mM NH4HCO3（pH8.0，含有0.15M NaCl和0.2g/L的NaN3）作为平衡和洗脱缓冲液，得到6个蛋白组份（P1-6）。然后以小分子合成多肽BApNA为底物，检测蛇毒丝氨酸蛋白酶的活性，采用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性。结果显示，丝氨酸蛋白酶活性主要集中在P3组分，P6组分也有一定活性；纤维蛋白平板活性检测结果显示，具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶只存在于P3组分中。SDS-PAGE蛋白质电泳结果显示，P3组分为混合物，需要做进一步的分离。
（2）阴离子交换层析分离：用HiTrap DEAE FF 16/10阴离子交换层析柱对P3组份进行进一步的分离纯化。上样后以A液（50mM NH4HCO3，pH8.2）洗脱未结合的组份，之后从A液到70% B液（50mM NH4HCO3，1M NaCl，pH8.2）进行线性梯度洗脱，得到5个蛋白组份。BApNA为底物测定活性，结果显示：丝氨酸蛋白酶活性主要集中在P3-2和P3-3组份；纤维蛋白平板检测结果显示，P3-3组份的纤溶活性最高。SDS-PAGE蛋白质电泳结果显示，P3-3组分为非单一条带，所以将进行第三步阳离子交换层析。
（3）阳离子交换层析分离：P3-3组分经阳离子交换层析技术（HiTrap CM FF 16/10）分离，以buffer A（50mM NH4AC，pH 5.6）为平衡缓冲液，以buffer B（50mM NH4AC，1M NaCl，pH 5.6）为洗脱缓冲液，得到3个蛋白组份（P3-3-1，P3-3-2和P3-3-3）。酶活性测定结果表明：丝氨酸蛋白酶活性主要集中在P3-3-2和P3-3-3组分，纤溶活性主要集中在P3-3-2组分中。
2. 生物活性表征
（1）蛋白纯度鉴定：P3-3-2在还原性SDS-PAGE（12%）分析显示4条带，其中分子量较大的两条带在35kDa上下，另外两条带14.4-18.4 kDa之间。在非还原性蛋白质电泳中P3-3-2显示为一条主带和一条次带。将SDS-PAGE电泳的条带切下，进行质谱鉴定。
（2）质谱鉴定结果：P3-3-2可能为丝氨酸蛋白酶与C-型凝集素样蛋白形成的复合物，其中两个丝氨酸蛋白酶分子量分别为35kDa（与毒腺cDNA文库中的SP1对应）和27.2kDa（与毒腺cDNA文库中的SP9对应），C-型凝集素样蛋白α链和β链的分子量分别为17.7kDa和14.3kDa。Gel-pro软件分析组分含量，P3-3-2中丝氨酸蛋白酶的总含量约为7%。
（3）酰胺水解活性测定：选用3种不同的多肽底物（T1637，B2133和S2266）测定P3-3-2的酰胺水解活力大小，计算催化效率（Kcat/km），由此确定P3-3-2的最适多肽底物。实验结果显示，P3-3-2的最适底物是T1637。
（4）抑制剂对P3-3-2酶活力的影响：以不加抑制剂的P3-3-2为对照组，实验组P3-3-2分别与不同的抑制剂（10mM PMSF、5mM EDTA、5% β-ME（v/v））在37℃孵育20min，然后以BApNA为底物，测定丝氨酸蛋白酶活性（405nm处吸光度值）。与不加任何抑制剂的对照组相比，丝氨酸蛋白酶特异性抑制PMSF能够显著抑制P3-3-2对BApNA的水解活力（抑制88%），EDTA对P3-3-2的活性没有明显的影响，β-ME也能够降低P3-3-2对BApNA的水解活性（抑制51%）。
（5）纤溶活力测定：采用纤维蛋白平板法比较P3-3-2与注射用纤溶酶的纤溶活力大小。结果显示，在等量蛋白酶的情况下，20μg P3-3-2（相当于1.4μg丝氨酸蛋白酶）形成的透明圈比注射用纤溶酶（20μg）要小一些（前者相对活力26.25%，后者相对活力36.48%）。
（6）纤维蛋白原水解活性：将牛纤维蛋白原与P3-3-2在37℃下孵育不同的时间（5min, 15min,30min, 60min, 120min, 240 min），然后用12%的SDS-PAGE检测P3-3-2对纤维蛋白原各条链的水解情况。结果显示，与空白纤维蛋白原对照组相比，5min时P3-3-2就已经开始微弱的水解纤维蛋白原的β链，随着时间的增加，β链的条带逐步消失，到240min时，纤维蛋白原的β链完全被水解掉。在等量蛋白酶含量的情况下，比较P3-3-2与巴曲酶注射液对纤维蛋白原水解活力大小。结果显示，相同孵育时间下，P3-3-2对纤维蛋白原的水解能力要强于巴曲酶注射液。
（7）去糖基化分析：去糖基化分析使用肽 N-糖苷酶F（PNGase F）预先处理P3-3-2，然后SDS-PAGE检测变性条件下P3-3-2糖链去除程度，以BApNA为底物检测非变性条件下去糖基化对P3-3-2底物水解活力的影响。结果显示，变性条件下，相比于P3-3-2空白对照组，PNGase F 处理P3-3-2后，P3-3-2中两个丝氨酸蛋白酶分子量明显减小，表明P3-3-2中的两个丝氨酸蛋白酶都是糖蛋白。非变性条件下，相比于未处理组，糖链的去除可以降低P3-3-2对BApNA的水解活力，处理时间为7h时，活性降低25%，处理时间为14h时，活性降低40%。由此说明糖链可能参与P3-3-2中丝氨酸蛋白酶对多肽底物的催化过程。
（8）体外凝血时间测定：采用玻片法测定P3-3-2对小鼠体外凝血时间的影响。腹腔注射不同剂量P3-3-2 3h后眼球采血测定凝血时间。结果显示相比于生理盐水组，P3-3-2的低（10mg/kg）、中（20mg/kg）、高（40mg/kg）剂量组均能够显著延长小鼠的体外凝血时间：对照组时间为84.00±6.557s，低、中、高剂量组分别为124.67±11.676s、162.67±10.599s、205.00±7.221s。
（9）出血活性测定：采用小鼠背部皮下注射方法检测P3-3-2的出血活性。小鼠背部皮下注射不同剂量（10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg）的P3-3-2，生理盐水组注射等体积生理盐水。24h后处死小鼠，检测注射部位皮下是否有出血斑。结果显示，P3-3-2的低、中、高剂量组都没有产生出血斑，说明P3-3-2不具有出血活性。
结论：利用三种层析技术，从中介蝮粗毒中分离纯化得到一种具有纤溶酶活性的蛇毒丝氨酸蛋白酶（P3-3-2）组分，为两个丝氨酸蛋白酶（SP1和SP9）与C-型凝集素样蛋白形成的复合物，其中丝氨酸蛋白酶为糖蛋白，在P3-3-2中的含量约为7%。P3-3-2组分能快速水解牛纤维蛋白原β链，且水解活力明显高于巴曲酶，纤溶活性比注射用纤溶酶的低。同时，P3-3-2可以显著延长小鼠体外凝血时间，并且不会引起出血，有望开发为治疗血栓疾病的新型溶栓药物。