● 摘要
FAM76B是由339个氨基酸组成的细胞核蛋白，分子量约为39kDa。人源的FAM76B基因定位于11q21 染色体上，全长21468bp，生物学功能尚不明确。通过氨基酸序列比对，发现人的FAM76B氨基酸序列与大鼠、小鼠以及斑马鱼的FAM76B氨基酸序列相似度极高，说明FAM76B氨基酸序列高度保守，也暗示了FAM76B蛋白可能存在重要的生物学功能。
目前已知FAM76B氨基酸序列中存在组氨酸重复序列（poly-His domain）和Lys-225的泛素化（ubiquitination）位点。通过基因本体（Gene Ontology, GO)分析表明，含有组氨酸重复序列的蛋白大多数为核蛋白，其生物学功能与基因转录和神经发育密切相关。FAM76B蛋白定位在细胞核的核散斑体(Nuclear speckles)中，而核散斑体属于细胞核亚结构，可对RNA剪切复合体进行保存和组装。
FAM76B是本实验室以人颗粒蛋白前体（Progranulin，PGRN）作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选，所获得的与PGRN具有相互作用的新的蛋白质。我们前期已经通过GST-pull down 和CO-IP的方法进一步验证了两者的相互作用。PGRN是具有多重生物学功能的蛋白，主要涉及细胞增殖、伤口修复、生长发育以及神经系统发育等多种生理功能，同时PGRN与一系列疾病的发生密切相关，如肿瘤发生、神经退行性疾病、II型糖尿病、脂类代谢疾病及炎症等。尽管FAM76B与PGRN存在相互作用，但FAM76B是否参与上述疾病的发生，目前还不清楚。
为了深入研究FAM76B蛋白的生物学功能，本课题通过单克隆抗体制备技术，获得针对人FAM76B蛋白的单克隆抗体；由于人与小鼠FAM76B蛋白的氨基酸序列高度相似，本课题进一步验证了所获得针对人FAM76B的单克隆抗体可以特异识别小鼠的FAM76B蛋白。随后研究FAM76B在正常小鼠主要组织中的表达和分布；建立FAM76B基因敲除小鼠模型，初步探索FAM76B基因敲除小鼠表型的改变和相关疾病的发生机制，为探讨FAM76B蛋白的功能奠定了基础。本课题具体研究内容如下：
FAM76B单克隆抗体的制备及鉴定： 用纯化的原核人FAM76B-6His融合蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；以纯化的人FAM76B-6His作为包被抗原，采用间接ELISA方法筛选出阳性克隆的杂交瘤细胞。通过有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，将最终阳性克隆扩大培养，制备针对人FAM76B的单克隆抗体6株，分别命名为FAM76B McAb No.1-6。采用Western blot、免疫沉淀以及免疫细胞化学染色等手段，对所获得的单克隆抗体进行一系列的检测。
FAM76B蛋白在正常小鼠组织中的表达和分布：将人FAM76B蛋白的氨基酸序列与小鼠FAM76B蛋白的氨基酸序列进行比对，发现两者氨基酸序列相似度可达到98%，说明FAM76B蛋白高度保守。用上述所获的针对人FAM76B的单克隆抗体对鼠源FAM76B蛋白进行检测，同时通过Real-time PCR、Western blot及免疫组化的方法检测FAM76B在正常小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉以及脑组织的表达和分布。
FAM76B基因敲除小鼠的构建及鉴定：本实验室通过与公司合作，定制FAM76B基因敲除小鼠模型。通过PCR、Real-time PCR以及Western blot方法对本实验室繁育的FAM76B基因敲除小鼠后代，在基因组水平、RNA水平以及蛋白水平进行鉴定。
FAM76B基因敲除小鼠表型的初步分析：对本实验室繁育的FAM76B基因敲除小鼠的雌雄比例、不同基因型比例进行统计。对不同时期小鼠的体质量、体长、肝脏、肾脏、脾脏以及脂肪组织称重，分析FAM76B基因敲除小鼠生长发育特征。
FAM76B基因敲除小鼠肝脏和脂肪的组织病理学特征分析：对不同时期小鼠肝脏组织进行H&E染色和油红染色，对脂肪组织进行H&E染色，分析小鼠肝脏和脂肪的组织病理特征。
FAM76B基因敲除小鼠相关血清指标分析：通过全自动生化分析仪检测FAM76B基因敲除小鼠血脂指标（TG、CHOL、HDL和LDL）和肝功能指标（ALT和AST），分析FAM76B基因敲除小鼠是否存在血脂异常及肝脏损伤。
FAM76B基因敲除小鼠肝脏脂代谢相关基因表达的分析：利用Real-time PCR方法，检测1，3，6，9，12，15月龄FAM76B+/-小鼠肝脏组织脂代谢相关基因的表达水平：de novo lipogenesis环节中FASN、SCD、ACC、Dgat 1和Dgat 2；脂肪酸氧化途径中Cpt1、Acox和 Mcad；TG分泌过程中Mtp和Vldlr。同时检测lipin1、SREBP-1、PPARα和PGC-1α的mRNA相对表达量。通过上述研究结果，分析FAM76B基因敲除小鼠肝脏脂代谢异常的主要因素和途径。
FAM76B基因敲除小鼠肝脏中F4/80、TNFα和PGRN基因表达的分析：检测1，3，6，9，12，15月龄FAM76B+/-小鼠肝脏组织中F4/80、TNFα和PGRN的mRNA水平，分析FAM76B在炎症反应中的作用。
通过以上实验内容，本课题获得了以下结果：
1. FAM76B单克隆抗体的制备及鉴定
最终获得针对人FAM76B的单克隆抗体6株，分别命名为FAM76B McAb No.1-6。经过Western blot、免疫沉淀以及免疫细胞化学染色等手段研究发现，发现FAM76B McAb No.1, No.2 和No.5抗体对人源FAM76B蛋白具有很好的亲和性，适用于人源FAM76B蛋白的Western blot、IP以及免疫细胞化学等检测，为研究FAM76B的功能提供了有利的工具。围绕组氨酸重复序列结构域构建多个的FAM76B截短体原核表达载体并进行小量诱导表达，通过Western blot检测发现FAM76B McAb No.3和No.6抗体所识别的表位在FAM76B蛋白的第97-163氨基酸之间；FAM76B McAb No.2 抗体所识别的表位在第187-262氨基酸之间；FAM76B McAb No.5抗体所识别的表位在第263-265氨基酸之间；FAM76B McAb No.1抗体所识别的表位在第266-339氨基酸之间。同时构建相应的FAM76B截短体真核表达载体，转染HEK 293细胞后进行免疫细胞化学染色，发现FAM76B蛋白的核定位信号肽位于组氨酸重复序列结构域的后端，大概位于第187-265氨基酸之间。
2. FAM76B蛋白在正常小鼠组织中的表达和分布
用上述制备的针对人FAM76B的单克隆抗体对鼠源FAM76B蛋白进行检测，发现FAM76B McAb No.1，No.2和No.5抗体对鼠源FAM76B蛋白也具有很好的亲和性，适用于鼠源FAM76B蛋白的Western blot检测和免疫细胞化学染色。通过Real-time PCR和免疫组化染色方法检测FAM76B在正常小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉以及脑组织的表达和分布，发现FAM76B在小鼠各组织中广泛分布，其中脑组织表达最高，其次是肝脏组织和脾脏组织。
3. FAM76B基因敲除小鼠的鉴定
对本实验繁育的FAM76B基因敲除小鼠子代，在基因组水平进行了鉴定，证实获得了三种基因型的小鼠子代；通过Real-time PCR实验在FAM76B的RNA水平进行鉴定，结果表明纯合子小鼠MEF细胞中FAM76B的mRNA几乎检测不到，杂合子小鼠MEF细胞中FAM76B的mRNA表达水平略高于50%；在蛋白水平，采用了本实验室制备的针对FAM76B的抗体对不同基因型的小鼠MEF中的FAM76B蛋白进行Western blot检测，结果表明纯合子小鼠MEF细胞不表达FAM76B蛋白，杂合子小鼠MEF细胞中FAM76B的蛋白表达量约为野生型的一半；上述实验结果表明FAM76B基因敲除小鼠已构建成功。
4. FAM76B基因敲除小鼠表型的初步分析
在生殖繁育方面，雌雄比1：1，野生型:杂合型的比例约为1:2，基本符合孟德尔遗传学定律，但纯合子小鼠比例明显下降(39.5% +/+，51.5% +/-，9% -/-)，表明纯合型FAM76B基因敲除小鼠的产率较低，推测可能FAM76B基因对胚胎发育方面存在某种影响，造成部分纯合子小鼠胚胎死亡以及出生鼠死亡，最终导致出生比例发生明显的波动。
在生长发育方面，1-5月龄杂合型FAM76B基因敲除小鼠的体质量相比野生型小鼠，没有明显的差异；6-8月龄杂合型FAM76B基因敲除小鼠的体质量高于野生型小鼠，并且体质量差逐步拉大；9月龄和15月龄，FAM76B杂合型基因敲除的小鼠体质量明显大于野生型，存在显著性差异。同时杂合型FAM76B基因敲除小鼠的肝脏和脂肪重量的变化的趋势与体质量相似。通过长期对杂合型FAM76B基因敲除小鼠生长发育的观察和测量，发现FAM76B基因敲除与小鼠肥胖有关。
5. FAM76B基因敲除小鼠肝脏和脂肪的病理学特征
对1-9月龄、12月龄和15月龄杂合型FAM76B基因敲除小鼠的肝脏HE染色结果表明：杂合型FAM76B基因敲除小鼠呈现进程性脂肪变性和炎症反应。HE实验结果表明：相比WT小鼠，在1-3月龄期间FAM76B+/-小鼠肝脏细胞在高倍镜下观察无明显的囊泡脂滴。4-5月龄期间，FAM76B+/-小鼠肝脏细胞在高倍镜下开始能够观察到多囊泡型脂滴。6-8月期间，FAM76B+/-小鼠组肝脏细胞在高倍镜下能够观察到少量的大泡型脂滴和大量囊泡型脂滴。9和15月龄期间，WT鼠肝脏组织内出现零星的大泡脂滴，肝脏细胞内有少量囊泡型脂滴；FAM76B+/-小鼠组肝脏组织中出现大量空泡。肝细胞能观察到较多的大泡型脂滴并且比例随着月份的增加，同时细胞内含有大量囊泡型脂滴，尤其15月龄FAM76B+/-小鼠组观察到轻度肝小叶炎症。依据NAFLD 病理学分析的半定量评分系统结合Matteoni等提出的建议，对不同月份FAM76B+/-小鼠组进行病理学评分，8和9月龄的FAM76B+/-小鼠分类为1级，15月龄的FAM76B+/-小鼠组分类为2级，其他组未到到病理级别。以上结果说明，随着年龄的增长，FAM76B+/-小鼠组肝脏非酒精性脂肪肝的病变程度逐步增强。提示FAM76B的缺失影响肝脏非酒精性脂肪肝的形成和发展。
肝脏油红染色显示：杂合型FAM76B+/-小鼠相比WT小鼠，1-3月龄期间均无明显的有脂滴，染色无明显差异。4-5月龄期间，杂合型FAM76B+/-小鼠组，存在明显脂滴，但脂滴直径较小密度较低。6-8月龄期间，杂合型FAM76B+/-小鼠组，大泡型脂滴明显逐步数量增多。9和15月龄，大泡型脂滴明显。油红染色结果与病理学观察结果相符合。
腹腔脂肪细胞形态学观察显示：FAM76B+/-小鼠与WT小鼠相比，1-3月龄期间腹腔脂肪细胞的面积没有明显差异。4-7月龄期间腹腔脂肪细胞的面积差距逐步变大，但差异不明显。8-15月龄期间，FAM76B+/-小鼠组腹腔脂肪细胞面积大于对照组。
6. FAM76B基因敲除小鼠血清指标分析
仅1和3月龄的FAM76B+/-小鼠血清中TG水平明显高于野生型小鼠，差异显著。其他月龄FAM76B+/-小鼠血清中TG水平略高于野生型小鼠，但差异不明显；1月、3月、9月和12月份，FAM76B+/-小鼠血清中CHOL水平明显高于野生型小鼠，差异显著，6和15月龄的FAM76B+/-小鼠血清中CHOL水平高于野生型小鼠，但没有显著性差异；FAM76B+/-小鼠血清中HDL水平仅在12月存在显著性差异外，其他月龄没有明显的差异；各组间LDL的水平没有显著性差异。检测FAM76B基因敲除小鼠肝功能指标，发现15月龄的FAM76B+/-小鼠血清中ALT达到较高值，并与野生组相比存在显著性差异，其他组ALT无明显差异。AST各组之间均无明显差异。上述结果表明，FAM76B的缺失对小鼠的血脂没有明显的影响，15月龄的FAM76B+/-小鼠存在一定的肝脏损伤。
7. FAM76B基因敲除小鼠肝脏脂代谢相关基因的表达
检测了不同时期FAM76B+/-小鼠和野生型小鼠肝脏的脂代谢相关基因的表达，实验结果表明：de novo lipogenesis环节中FASN和SCD的mRNA相对表达量上升，存在显著性差异。TG分泌过程中Vldlr的mRNA相对表达量上升。说明FAM76B+/-小鼠可能由于脂肪酸合成提高和TG分泌降低，造成肝脏细胞的TG沉积，最终导致非酒精性脂肪肝的形成。
分别检测了不同时期 FAM76B+/-小鼠和野生型小鼠肝脏中lipin1、SREBP-1、PPARα和PGC-1α的mRNA相对表达量，其中SREBP-1的相对表达量显著上升，FASN和SCD是SREBP-1转录调控的下游分子，相对表达量也升高，说明FAM76B可能通过影响SREBP-1的表达，从而影响脂肪酸的合成；另一方面，lipin1和PGC-1α的相对表达量明显下降。说明FAM76B可能通过影响lipin1和PGC-1α的相对表达，干扰vldl分泌途径，导致TG分泌降低。检测发现，PPARα的相对表达量没有明显的变化，说明FAM76B可能不通过PGC-1α/PPARα/lipin1 途径影响脂肪酸的氧化反应，这与上述脂肪酸氧化途径中Cpt1、Acox和 Mcad的mRNA相对表达量没有明显变化的实验结果相一致。
8. FAM76B基因基因敲除小鼠肝脏中F4/80、TNFα和PGRN基因的表达
1-3月龄时，FAM76B+/-小鼠和野生型小鼠肝脏中，F4/80和TNFα的mRNA 没有明显差异。6月龄后，FAM76B+/-小鼠中F4/80和TNFα的mRNA明显升高，与同期野生型小鼠相比，差异极显著。15月龄时FAM76B+/-小鼠中F4/80和TNFα的mRNA相对表达量最高，这与15月龄FAM76B+/-小鼠病理学观察发现轻度肝小叶炎症型相符。F4/80是巨噬细胞表面分子，TNFα是促炎因子，说明FAM76B+/-小鼠的炎症反应逐步加强，这与非酒精性脂肪肝的进程相一致。同时，提示FAM76B具有抑制炎症反应的作用。1-12月龄时，FAM76B+/-小鼠相比野生型小鼠肝脏中PGRN的mRNA 表达较高，但不存在明显差异。15月龄后，FAM76B+/-小鼠中PGRN的mRNA明显升高，与同期野生型小鼠相比，差异极显著，这与同一时期，FAM76B+/-小鼠中TNFα的mRNA相对表达量最高以及病理学观察发现轻度肝小叶炎症型一致。推测FAM76B和PGRN可能在非酒精性脂肪肝炎症反应中可能存在相互作用。
综上所述，FAM76B在小鼠各组织中广泛分布，其中脑组织表达量最高，其次是肝脏组织和脾脏组织。FAM76B基因敲除会导致小鼠肝脏脂代谢异常和炎症反应升高。其分子机制可能是FAM76B基因敲除上调了小鼠肝脏中SREBP-1、FASN和SCD的基因表达，促进脂肪酸合成；下调lipin1、PGC-1α和上调vldlr的表达抑制TG分泌，导致脂质沉积。另一方面，FAM76B基因敲除上调小鼠肝脏中TNFα和PGRN表达，促进肝脏组织的炎症反应。通过以上因素协同诱导NAFLD病变。上述研究结果为进一步阐明FAM76B的生物学功能、FAM76B基因敲除对小鼠肝脏脂代谢异常的作用机制以及为深入研究FAM76B与PGRN相互作用在NAFLD发生过程的分子机制奠定基础。
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