题目：CCDC152：一个调控细胞G1/S限制点的高尔基体蛋白

前言：CCDC152 (Coiled-coil Domain Containing Protein 152) 属于含有卷曲螺旋（Coiled-coil）结构域蛋白家族的成员之一，其含有4个卷曲螺旋域，但该蛋白的功能未知。在真核生物中，许多蛋白质专一性的相互作用由特殊的domain或者motif所介导，而卷曲螺旋就是介导蛋白质之间专一性相互作用的蛋白结构域。含有卷曲螺旋结构域的高尔基体蛋白通常称为“Golgins”，最初被鉴定为一组在自身免疫疾病患者的血清中发现并定位于高尔基体的蛋白。Golgins和高尔基体重组堆放蛋白（GRASP）被认为是形成高尔基体的结构骨架（或Golgi matrix），在高尔基体结构和功能中起着重要作用。近年来研究发现,高尔基体蛋白通过调控细胞周期检验点的相关激酶来调控细胞周期的进行，因此高尔基体也被认为是细胞周期的“高尔基体检验点”。高尔基体检验点的特点是通过感应高尔基体的完整性而非传统的DNA损伤修复来调控细胞周期的。尽管高尔基体的解聚是如何调控细胞周期的机制目前还不是很清楚，但是这些发现揭示细胞器的遗传性和信号途径协同来调节细胞分裂的机制。检验点激酶1（Chk1）/CDC2和pRb（视网膜母细胞瘤蛋白）是细胞周期检验点调控的重要激酶。CDC2最初在裂殖酵母中被发现，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。Rb是一种肿瘤抑制基因，该基因产物pRb与E2F家族的转录因子相互作用形成pRb-E2F复合物进而负调控细胞周期的进行。已有研究表明CDC2可以磷酸化pRb蛋白S807/811位点使其失去活性，导致E2F家族转录因子的释放，释放的E2Fs结合到靶DNA并激活DNA的转录。CDC2-pRB-E2F形成一个正反馈循环，但当CDC2蛋白T14/Y15位点被磷酸化后，CDC2蛋白激酶活性丧失，导致pRb-E2F复合物增多，DNA转录受到抑制和细胞周期的停滞。
本研究发现CCDC152是一个新的高尔基体蛋白，并且参与了细胞周期G1/S期的转换。
  材料及方法：
（1）研究CCDC152蛋白在细胞中的定位：制备293T细胞爬片并固定，用免疫组织化学方法分析内源性CCDC152在细胞周期中表达定位及变化；构建CCDC152-YFP黄色荧光蛋白融合表达载体，转染293T细胞，观察外源性CCDC152-YFP在细胞周期中的定位及形态变化。采用已知的高尔基体标志物黄色荧光蛋白融合表达载体Golgi-YFP作为对照，将Golgi-YFP和CCDC152-YFP分别转染293T细胞并且用秋水仙素和BFA药物处理，观察CCDC152-YFP和Golgi-YFP在药物处理后的变化。进一步通过干涉CCDC152来观察Golgi-YFP变化。
  （2）研究CCDC152对细胞周期的调控作用：将CCDC152表达载体和合成好的干涉CCDC152的双链RNA分别转染293T细胞，通过流式细胞方法研究过表达和干涉CCDC152对细胞周期的影响; 制备293T细胞爬片，然后将CCDC152表达载体和合成CCDC152干涉的RNA分别转染293T细胞，做BrdU的免疫组织化学分析，通过观察过表达和干涉CCDC152后BrdU掺入量变化，来分析CCDC152对细胞周期S期DNA复制的影响。
  （3）研究CCDC152对细胞周期检验点激酶表达的影响：将CCDC152表达载体和合成好的干涉CCDC152的双链RNA分别转染293T细胞，Western Blot检测CCDC152对细胞周期限制点(restriction point)  pRb，CDC2，p53等表达的影响。
  结果：
  （1）内源性CCDC152的表达随着细胞周期的进行呈现周期性变化：在细胞分裂间期，CCDC152的表达呈马蹄形分布于细胞核周边；随着细胞进入分裂期，CCDC152逐渐弥散在整个胞浆中；而当细胞进入细胞分裂末期，CCDC152的表达重新聚集于细胞核周边。另外，外源性CCDC152-YFP的表达与内源性CCDC152表达在细胞周期中变化一致。秋水仙素和BFA药物处理后CCDC152-YFP的表达呈现弥散,这种变化与药物处理后的Golgi-YFP变化一致。干涉CCDC152后Golgi-YFP的表达呈现弥散。
  （2）过表达CCDC152后细胞周期G1期细胞数减少，而S期的细胞数增多;干涉CCDC152后细胞周期G1期和S期细胞数变化不明显。BrdU的免疫组织化学结果显示过表达CCDC152后BrdU掺入DNA的量增加，而干涉CCDC152后BrdU掺入DNA的量增加更明显。即过表达和干涉CCDC152后都导致S期DNA的合成的增加。
  （3）CCDC152对细胞周期检验点激酶表达的影响：过表达CCDC152后pRb-S807/811表达上调，即pRb激酶的S807/811位点磷酸化修饰增强，干涉CCDC152后pRb激酶的磷酸化修饰增强更加明显;而过表达CCDC152后CDC2-Y15表达下调，即CDC2激酶的Y15磷酸化修饰减弱，干涉CCDC152后CDC2激酶磷酸化修饰减弱更明显。而p53-S15在过表达和干涉CCDC152后变化不明显。这表明CCDC152通过调控细胞周期检验点激酶pRb和CDC2的磷酸化修饰来调控细胞周期G1/S期的转换。
  结论：
  （1）CCDC152 是一种高尔基体蛋白；
  （2）CCDC152 通过调控细胞周期检验点pRb和CDC2激酶的磷酸化修                         
       饰来调控细胞周期进行；
  （3）CCDC152参与细胞周期G1/S转换的调控。
  本研究为高尔基复合体调控细胞周期的假说提供了新的证据。