题目：丹参叶内生真菌群落结构与其有效成分关系研究

摘 要
内生真菌 (Fungal endophytes) 是指在其生活史中的某一阶段存在于健康植物组织内，不会引起宿主植物明显病症或造成明显伤害的真菌。内生真菌能够促进宿主植物生长，增强其抗病虫害和抗逆能力，并与植物次级代谢产物的合成关系密切。研究表明，植物次级代谢产物的合成往往是植物在自然环境中经常受到如病虫害或生物、非生物诱导子的刺激时而产生的一种过敏性防御反应，而生活在药用植物这一特殊环境体内的内生真菌不仅能促进宿主次生代谢物质的生成，而且有些内生真菌还能够自身合成与宿主相同或相似的活性成分。因此，对药用植物内生真菌进行全方位的“生物勘探”成为当前生态学、植物学、天然药物化学等诸多相关领域的研究热点。挖掘高活性的内生真菌、揭示内生真菌和宿主的共生关系对于药用植物资源的合理开发、利用和保护具有重要意义。
丹参 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 为唇形科 (Labiatae) 鼠尾草属 (Salvia) 植物中被历版《中华人民共和国药典》收载的唯一品种，有祛瘀止痛和活血通经的功效，常用于心绞痛和冠心病等症的治疗。作为我国传统名贵大宗药材，在我国广泛种植，因其代谢产物脂溶性成分丹参酮 ⅡA、水溶性成分丹参素和迷迭香酸等具有抗菌、抗炎、抗血栓、抗氧化以及治疗心血管疾病等多种药理学活性，所以丹参有效成分的合成机制以及以丹参为原料的药物研发受到了高度关注。已有的研究较多关注的是丹参有效成分的代谢过程及其药理作用，对于丹参内生真菌与其有效成分间关系的研究鲜有报道。
本研究以采自5个不同地区的丹参 (HUB5，湖北罗田；AH87，安徽六安；HEN5，河南南阳；SD01，山东临沂和HEN7，河南三门峡) 为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性分析 (T-RFLP) 方法探究了不同产地丹参叶内生真菌群落结构的差异性；采用高效液相色谱 (HPLC) 技术探究了不同产地丹参有效成分的积累规律，经过统计分析研究了丹参内生真菌与其有效成分间的相关性。主要研究结果如下：
1. 不同产地丹参叶内生真菌酶切T-RFs片段数 (Cfo I, Hae III, Msp I 和Taq I的单一酶切结果，以及四种酶切产物总体) 有显著性差异 (P＜0.05)；不同产地丹参叶内生真菌总体多样性指数大小为：HUB5＞AH87＞HEN5＞SD01＞HEN7；丹参叶内生真菌分别经四种酶切后，不同产地间共有的T-RFs片段数分别为45、42、38和34条；基于4种酶切T-RFs组成 (大小和峰面积) 的主成分分析 (PCA) 结果显示，HEN7与AH87 在内生真菌组成上相似性较高，聚为一类，位于排序坐标系的第二象限；SD01与HUB5在内生真菌组成上相似性较高，聚为一类，位于排序坐标系的第三象限；HEN5其内生真菌群落结构与其它4种丹参样品分异明显，位于排序坐标系的第一象限。结果表明不同产地丹参叶内生真菌群落结构有一定的差异性和相似性。
2. 采用HPLC法对不同产地的丹参叶与根系中的水溶性酚酸类成分和脂溶性二萜醌类成分进行测定。
就叶有效成分而言，其主要脂溶性成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量在5种丹参叶中差异不显著 (P＞0.05)，丹参酮 I和丹参酮 IIA的含量在5种丹参叶中有显著差异 (P＜0.05)。其主要水溶性成分迷迭香酸、丹酚酸B、丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛的含量在5种丹参叶中差异显著 (P＜0.05)，但咖啡酸在样品HEN7、AH87和HUB5中差异不显著 (P＞0.05)。基于叶24种有效成分的PCA结果显示，HEN5、HEN7和AH87间有效成分组成相似性较高，3种丹参样品聚为一类，三者位于排序坐标系的第三象限；而SD01和HUB5有效成分相互之间分异明显，二者分别位于排序坐标系的第一象限和第四象限，分异性较大。
就根系有效成分而言，其主要脂溶性成分二氢丹参酮 I、鼠尾草酚、隐丹参酮、鼠尾草酸和丹参酮 IIA的含量在5种丹参根部中差异显著 (P＜0.05)，HUB5和HEN5的丹参酮 I的含量差异不显著 (P＞0.05)。其主要水溶性成分迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A、和咖啡酸的含量在5种丹参根部中差异显著 (P＜0.05)，但丹参素含量差异不显著 (P＞0.05)；基于根系24种有效成分的PCA结果显示，SD01和HEN7间有效成分的相似性较高，2种丹参样品聚为一类，二者位于排序坐标系的第四象限；HEN5和HUB5有效成分相互之间分异不明显，二者分别位于排序坐标系的第二象限；而AH87则单独聚为一类，与其它4种丹参样品分异性较大，位于排序坐标系的第三象限。
基于叶与根系总24种有效成分的PCA结果显示，AH87和HEN5间的有效成相似性较高，聚为一类，位于排序坐标系的第三象限；HUB5和SD01间的有效成分相似性较高，聚为一类，位于排序坐标系的第一象限；HEN7单独聚为一类，位于排序坐标系的第四象限。
3. 不同产地丹参叶和根系中的24种有效成分含量与内生真菌四种酶切共有 (指同一种内切酶酶切5种样品后均出现的T-RFs) T-RFs条带组成 (大小和峰面积) 间的相关性分析结果显示，Cfo I、Hae III、Msp I 和Taq I 酶切共有T-RFs条带中，分别有7、8、5和3个条带分别与丹参叶及根系中的一些有效成分呈显著 (P＜0.05) 或极显著 (P＜0.01) 的相关性。进一步印证了丹参内生真菌与其有效成分组成具有密切关系，有必要进一步研究。