题目：一种新的与PGRN相互作用蛋白的验证及其功能研究

      颗粒前体蛋白（Progranulin，PGRN）定位于人染色体17q21.32。作为一种分泌性糖蛋白分子，其蛋白由593个氨基酸组成，包含一个分泌信号肽和七个半高度保守的半胱氨酸衔接的重复结构域，这七个半结构域分别被命名为paragranulin、granulin（Grn）G、F、B、A、C、D和E。由于PGRN的氨基酸序列中含有四个糖基化位点，其成熟的蛋白约88kDa。PGRN在人体内的多种细胞、组织或器官中广泛分布，其中脾脏、生殖系统、肺、肾以及皮肤等这些富含上皮细胞的组织或器官中分布较多，另外在某些神经细胞以及大多数的肿瘤细胞中也有较高的表达。目前对PGRN功能的研究发现，其参与多种生理及病理活动，包括神经系统发育，细胞增殖、损伤修复、炎症反应、糖尿病以及肿瘤的发生和浸润等。PGRN在各种生理或病理活动中发挥其生物学功能的分子机制至今尚未阐明，而蛋白质在机体发挥生物学功能大多依赖与其他蛋白的相互作用。因此，寻找能与PGRN相互作用的蛋白质分子并验证蛋白分子相互作用后产生的功能变化对阐明PGRN功能的分子机制具有重要的研究意义。

      通过酵母双杂交系统与生物信息学分析相结合，本实验室前期的研究筛选出一些与PGRN相互作用的候选分子，其中候选分子双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A（Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A， DYRK1A）引起我们的关注。因为近年来对该分子的研究表明，DYRK1A作为一种激酶通过对其作用底物的磷酸化调节多种分子的活性及表达量，从而参与多种信号通路及疾病病理形成。巧合的是，已经报道的DYRK1A的功能主要表现在神经退行性疾病方面，其病理程度与DYRK1A成剂量依赖关系；也有研究报道，DYRK1A的表达异常对于肿瘤的形成、恶性程度及复发性也有影响；甚至近期有文章报道DYRK1A单倍剂量不足的小鼠会表现出糖尿病的症状。因此提示我们PGRN可能会影响DYRK1A与其底物的作用或是影响其激酶活性以调节其在信号通路中的作用，或者是DYRK1A通过调节PGRN与其他蛋白之间的相互作用以影响PGRN的生物学功能。本课题旨在通过探究PGRN与DYRK1A之间的相互作用及对细胞增殖的影响，从而探讨二者在细胞增殖及神经分化方面的作用。

      本课题主要包括两部分，即验证PGRN与DYRK1A的相互作用以及探究二者相互作用在细胞增殖方面的作用。首先通过酵母双杂交系统、免疫共沉淀、GST-pull down等技术进一步验证两分子的相互作用；并利用激光共聚焦显微镜技术观察二者在细胞中的共定位；然后研究二者相互作用对细胞增殖及分化的影响；最后，通过建立DYRK1A基因敲除的细胞系进一步研究其生物学功能，通过上述研究为阐明PGRN发挥生物学功能的分子机制奠定基础。具体而言，本课题研究内容包括以下几个部分：

      （1）PGRN与DYRK1A相互作用的验证：首先利用巢式PCR技术从人源cDNA文库中扩增DYRK1A的基因全长，并将其克隆入酵母表达载体，利用酵母双杂交技术，验证PGRN与DYRK1A的相互作用。然后，根据DYRK1A的氨基酸结构构建不同的DYRK1A的截短体，克隆入酵母表达载体，同样利用酵母双杂交技术研究PGRN或Grns与DYRK1A相互作用的具体部位。结果表明：在PGRN分子中，与DYRK1A相互作用的部位位于GrnB、GrnA和GrnC部分，而DYRK1A分子中，与PGRN相互作用的部位位于其C端的His富集区。之后又利用免疫共沉淀和GST-pull down技术验证两个蛋白在哺乳动物细胞内以及体外的相互作用，进一步证实了酵母双杂交实验的结果。最后，再利用激光共聚焦显微镜技术，研究PGRN与DYRK1A两个分子在CHO细胞内的分布及共定位情况，结果表明：当PGRN与DYRK1A共转染入CHO细胞时，PGRN可以部分从细胞质转位至细胞核，DYRK1A也有部分从细胞核转位至细胞质，即共转染后两分子在细胞内的分布均发生变化，最终PGRN和DYRK1A都是在整个细胞范围内分布。

      （2）PGRN与DYRK1A介导细胞功能的研究：首先，选择SH-SY5Y细胞探究PGRN与DYRK1A相互作用对细胞分化的影响。结果显示：DYRK1A过表达可以促进SH-SY5Y细胞的分化，而PGRN则表现出对DYRK1功能的拮抗。并且PGRN比Harmine更加明显的抑制DYRK1A的促分化作用。然后，选择HEK293细胞，利用MTT法检测PGRN与DYRK1A相互作用对细胞增殖的影响。结果显示：过表达DYRK1A会抑制HEK293细胞的增殖，Harmine，PGRN及PGRN-BAC都能够拮抗DYRK1A对细胞增殖的抑制作用，从而表现出促进细胞增殖，而且相比于PGRN-BAC和Harmine，PGRN全长拮抗DYRK1A对细胞增殖抑制的作用更为明显。接下来，为了验证PGRN与DYRK1A相互作用对细胞增殖及分化影响的分子机制，本课题分别从mRNA水平和蛋白水平探究，选择细胞周期相关的分子P27kip1和Cyclin D1进行检测。结果表明：在mRNA水平，PGRN对DYRK1A，PGRN或DYRK1A对P27kip1和Cyclin D1均没有明显影响，而在蛋白水平，Harmine，PGRN和PGRN-BAC都会影响DYRK1A对P27kip1和Cyclin D1的调控，证明PGRN通过影响DYRK1A对底物（P27kip1和Cyclin D1）的作用从而促进细胞增殖，并且PGRN全长有比Harmine和PGRN-BAC更为明显的效果。再然后，利用实时定量PCR技术检测DYRK1A在不同细胞的内源表达情况。结果表明：DYRK1A在肿瘤细胞HepG2，MCF-7和U87中表达量比正常细胞HEK293低，在神经细胞SH-SY5Y细胞中表达量高。最后，为了进一步探究DYRK1A介导的细胞学功能，本课题利用Cas9-sgRNA技术建立DYRK1A基因敲除的SH-SY5Y细胞系。目前的结果显示：得到了针对DYRK1A具有切割活性的sgRNA，并成功对靶序列进行切割，更多的功能学探究还有待进一步的实验数据。

      总结上述研究，本课题获得了以下研究结果：（1）通过酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，GST-pull down技术和激光共聚焦显微镜方法证实了PGRN与DYRK1A两蛋白分子的相互作用；（2）利用酵母双杂交系统发现在PGRN中，与DYRK1A相互作用部位集中在GrnB、A、C，而在DYRK1A分子中，与PGRN相互作用的部位位于其C端His富集区；（3）发现了DYRK1A对SH-SY5Y细胞的分化有促进作用，而PGRN能够抑制DYRK1A的作用；（4）验证了DYRK1A对HEK293细胞的增殖有明显的抑制作用，发现PGRN和PGRN-BAC都能够拮抗这一抑制作用，PGRN比PGRN-BAC的作用更加明显；（5）探究了PGRN与DYRK1A相互作用对细胞增殖及分化作用的分子机制，发现PGRN影响了DYRK1A对其底物P27kip1和Cyclin D1的调控，从而促进细胞增殖，抑制细胞分化，即发现了PGRN影响细胞增殖和分化的一条途径；（6）利用Cas9-sgRNA技术建立DYRK1A基因靶序列敲除的SH-SY5Y细胞系。