● 摘要
摘 要航天员在航天飞行条件下出现“航天飞行性贫血”（space flight anemia）的病理现象,而红细胞生成受阻可能是“航天飞行性贫血”的重要原因。促红细胞生成素（Epo）通过Epo受体在红细胞生成过程中起主导作用。本实验观察NASA慢回转器模拟微重力环境对Epo诱导人红白血病细胞系K562细胞向红系分化的影响，特别是对K562细胞膜上一些蛋白的运输、定位的影响和细胞骨架的影响，细胞骨架的变化与蛋白质运输的关系。论文分以下两个部分内容：第一部分，模拟微重力对K562细胞分化的影响。K562细胞置入NASA慢回转器旋转细胞培养装置内培养，加入红细胞生成素（Epo）1U/ml，以20 rpm旋转48 h后取细胞进行实验，同时设地面对照。细胞计数分析细胞增殖情况；联苯胺染色法检测细胞血红蛋白合成情况；用FITC标记的抗体和流式细胞术检测红细胞分化标志蛋白血型糖蛋白A（GPA）和转铁蛋白受体（CD71）在细胞表面的表达情况；用Oregon Green® 488结合的鬼笔环肽和紫杉醇分别显示纤维型肌动蛋白F-actin和聚合型微管蛋白，流式细胞仪和荧光显微镜检测并观察细胞骨架的变化。K562细胞在旋转培养48h后细胞密度为（3.1±1.0）×105/ml，而地面培养细胞密度为（4.5±1.1）×105/ml，两组间差异有显著性；加入Epo可明显促进地面培养细胞增殖，密度为（5.6±0.9）×105 /ml，而慢回转培养对Epo的刺激增殖作用有显著抑制作用，此时细胞密度降为（3.4±1.4）×105/ml。Epo可促进地面培养K562细胞红系分化，联苯胺阳性细胞从基础水平的5.9%增加到15%，而慢回转培养显著抑制Epo诱导的分化（降为9%）。慢回转培养还能显著抑制GPA和CD71在细胞表面的表达。此外，慢回转培养促进微管解聚，但没有观察到F-actin的明显变化。GPA和71在细胞表面表达量下降，有可能是模拟微重力环境使细胞骨架解聚，发生紊乱，使依赖于细胞骨架进行蛋白运输的途径发生障碍所至。而慢回转模拟微重力环境对这些细胞表面蛋白（其中还包括EpoR）表达的影响是引起Epo诱导K562细胞红系分化的抑制的原因之一。第二部分，建立胰蛋白酶消化细胞表面蛋白恢复模型。为进一步研究细胞骨架与蛋白质运输的关系，建立了胰蛋白酶消化细胞表面蛋白血型糖蛋白A和转铁蛋白受体CD71恢复模型。实验使用胰蛋白酶来消化K562细胞表面的蛋白的胞外部分，使之不被特异抗体识别，应用流式细胞仪检测血型糖蛋白A和CD71被消化后在细胞表面的FITC标记特异抗体识别率的恢复时间。结果发现，一定时间内胰蛋白酶消化对K562细胞活性影响不大，消化2h细胞活性也没有明显变化。胰蛋白酶消化K562细胞，细胞表面GPA在细胞表面的特异抗体识别率迅速下降，消化15min细胞表面GPA的特异抗体识别率降到1%以下，CD71在消化30min后降到3%以下。K562细胞在被胰蛋白酶消化30min后继续培养，GPA的细胞表面特异抗体识别率恢复较慢，72h才恢复到正常水平；而CD71恢复较快，在7h内恢复到正常水平。这些研究结果表明胰蛋白酶消化细胞表面蛋白恢复模型为研究细胞表面蛋白动力学变化规律和蛋白细胞膜定位影响因素研究提供了简便而有效的模型，为进一步研究微重力条件下细胞表面蛋白表达与细胞骨架的关系奠定了基础。同时，这些实验结果也显示，考虑到胰蛋白酶消化对实验结果产生的影响，在做细胞表面蛋白表达实验时应慎用胰蛋白酶。关键词：模拟微重力，血型糖蛋白A，转铁蛋白受体，细胞骨架，胰蛋白酶，红系分化