● 摘要
摘 要 短额负蝗 Atractomorpha sinensis I. Bolivar, 1905，隶属于直翅目蝗总科锥头蝗科，分布极其广泛，由于成虫和若虫多栖息在茎叶上取食，严重危害禾本科植物的生长发育。目前对于短额负蝗的研究主要集中在形态学、种群遗传多样性、配子发生和线粒体全基因组学等方面，有关短额负蝗的基因组和转录组研究分析未见报道。由于蝗虫基因组巨大，对其进行测序和生物学分析费用昂贵，且需要耗费大量的资源。与基因组相比，蝗虫的转录组规模相对较小，研究可行性较高，并且这类研究可以从不同类型细胞、处于不同发育阶段的生物体等角度对基因表达情况进行研究，同时也反映了研究对象的动态转录水平。 本研究利用Illumina HiSeq™ 2000测序平台，对短额负蝗若虫、雌性成虫和雄性成虫进行了转录组深度测序，在对测序结果进行拼接的基础上，采用生物信息学分析方法进行了短额负蝗转录组的全局分析。使用软件edgeR对三个样品的差异表达基因进行筛选和功能分析，为短额负蝗的发育和性别调控研究提供了大量信息。最后，通过对短额负蝗的线粒体进行转录组作图研究，获得了大量线粒体转录信息。本研究的主要结果如下： 1.短额负蝗若虫、雌性和雄性成虫三个样品的转录组测序共获得20 Gb数据。若虫测序获得54,122,927对读序，雌性成虫共得到24,713,322对读序，雄性成虫共得到22,979,536对读序。通过对序列进行序列拼接和组装，最终获得60,382条短额负蝗的Unigene，平均长度为707 bp，GC含量为43.02%。采用Trinity软件对Unigene进行可读框预测，共预测得到29,705条CDS序列，平均长度为717 bp，即大部分蛋白编码基因编码氨基酸的个数超过了200个。 2.对获得的60,382条Unigene进行功能注释分析，使用Blast将序列与Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG、GO等数据库进行比对注释，发现有27,325个Unigene注释到以上数据库中，占到总数的45%。其中注释到GO数据库中的序列最多，共有14,749条，对其进行了细胞组分、分子功能和生物学过程三个类别的划分。大量基因都参与了分子功能，参与各种连接形式和催化活性的基因数量最多；在细胞组分中，被注释到细胞内的基因个数最多；而在各种生物学过程中，生理过程中注释到的基因个数最多。 3.在KEGG分析中，注释到遗传信息过程的基因数目最多，共4,391个，包括基因的复制和修复、RNA转录、蛋白质的翻译和加工修饰等过程，其中参与翻译的基因最多；其次为新陈代谢的基因数量，共有4,003个，包括各种氨基酸代谢、碳水化合物代谢、多糖的生物合成与代谢等；相比而言，注释到与代谢疾病相关的基因数量较少。另外，有81个基因注释到了发育过程中。 4.使用edgeR软件对短额负蝗若虫和成虫、雌性成虫和雄性成虫间进行差异表达基因的筛选，在若虫和成虫之间共筛选出9,069个差异表达基因，其中有5,925个基因在若虫中显著上调，3,144个在成虫中表达上调。对差异表达基因进行功能注释及功能分析，其中5,205条差异基因参与了GO分类，细胞组分中注释到了1,200个基因，生物学过程注释到了1,518个基因，2,487个基因被注释到了分子功能中，大部分都集中在各种结合（Binding）和活性（Activity）中。差异表达基因中有2,382个参与了KEGG代谢通路，主要参与了各种代谢途径以及遗传信息的加工过程，尤其是与昆虫激素合成的生物通路相关基因都发生了不同程度的差异表达，表明这些基因在短额负蝗生长发育方面具有重要的作用。 5.本研究在短额负蝗雌性成虫和雄性成虫中共筛选出1,879个差异基因，有608个基因在雌虫中上调，1,271个基因在雄虫中上调。其中806个差异基因注释到了GO数据库中，115个注释到相关细胞组分，448个基因参与了各种分子功能，243个基因注释到了生物学过程；193个差异基因参与到KEGG代谢通路中，CYP3A属于CYP450酶系，在雌性成虫中发生上调，推测其可能参与到昆虫性激素的生物合成过程。 6.通过短额负蝗全线粒体转录物作图，发现rRNA的转录效率高于蛋白编码基因，说明rRNA在核糖体的组装中起到了重要作用，因此终止因子结合在rRNA的3’端下游以终止转录活动，来维持rRNA的高含量水平。两对重叠基因ATP8/ATP6与ND4/ND4L是由一条双顺反子共同转录而来的。短额负蝗具有5个大的初级转录单元，通过“tRNA间断模型”进一步加工为成熟转录本。各个蛋白编码基因存在异质性表达，可能与转录本的不稳定性和转录后调控机制相关。