题目：丹参乙烯响应因子基因（SmERF1）的克隆及功能研究

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，以其根及根茎入药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的功效。丹参含有多种活性成分，主要有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，在临床上被广泛应用于心脑血管疾病及多种炎症的治疗。作为我国常用大宗药材之一，丹参需求量日益增长。随着现代中药材规范化种植技术的发展，我国逐渐形成了多个丹参栽培产区，但近年来病虫害已严重影响了丹参原药材的品质和产量。使用生物技术手段来深度挖掘丹参的抗病基因并进一步研究植物抗病机制，是筛选和培育优良丹参种质的有效策略。鉴于此，本课题立足于已有的研究成果，结合丹参转录组高通量数据库，从转录水平克隆得到1条乙烯响应因子基因（ethylene response factor, ERF），结合基因的生物信息学分析结果和表达模式分析情况，使用RNA干涉技术（RNAi）和外源基因转化技术对该基因的功能进行初步研究，为丹参的抗病机理研究提供了一定的参考资料。主要研究内容及结果如下： 1. 利用RT-PCR和PCR技术分别以丹参cDNA和gDNA为模板克隆得到1条AP2转录因子家族基因，该基因无内含子，其开放阅读框为621 bp，编码206个氨基酸。生物信息学分析显示：其蛋白分子量为15.003 kDa，等电点为5.887，为亲水性蛋白。 2. BlastP序列比对结果显示该基因与拟南芥、百脉根、猕猴桃和毛果杨等植物的ERF类转录因子相似度较高。该基因具有典型的AP2/ERF结合域，AP2/ERF结构域中的YRG元件区域，含有3个β折叠，其中第2个β折叠中的第14和19位的两个氨基酸残基分别为丙氨酸和天冬氨酸。根据该蛋白的氨基酸序列特点，将其归类于AP2超家族中EREBP亚族的分支——ERF类转录因子，并将该基因命名为丹参SmERF1。 3. 利用实时荧光定量PCR分析SmERF1基因的表达模式，结果显示：SmERF1基因在丹参根中的表达量显著高于茎、叶和花中；立枯丝核菌可显著诱导该基因的表达；同时还发现该基因能响应植物激素MeJA、ABA和ET的诱导。 4. 以pKannibal为中间载体，pART27为表达载体，通过PCR及限制性内切酶酶切的方法构建SmERF1基因的干涉载体，使用根癌农杆菌介导的叶盘法将重组表达载体转入丹参中。利用实时荧光定量PCR技术检测 SmERF1基因在丹参转基因株系中的表达丰度，筛选出干涉效果明显的11号、18号和22号3个丹参转基因干涉株系。 5. 选用立枯丝核菌，对SmERF1干涉株系和对照株系进行感染，观察各株系内与抗病相关的酶类和病理产物的变化情况。结果显示，在遭受病原微生物立枯丝核菌感染后，SmERF1干涉株系植株呈现出发病早、危害重等现象，体内的丙二醛（MDA）含量显著高于野生型株系（CK）和空载株系（PDK）株系，还原型谷胱甘肽（GSH）和脯氨酸（Pro）含量显著低于CK和PDK株系；检测与抗病相关的酶类活性发现，干涉株系中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性均显著低于CK和PDK株系，而过氧化物酶（POD）无显著性差异。 6. 利用实时荧光定量PCR技术检测干涉、CK和PDK株系中抗病相关基因以及次生代谢途径上关健酶基因的表达变化。结果显示，与对照相比，干涉株系抗病相关基因中，病程相关蛋白基因PR-10、SmSTH-2和丹参防御素基因PDF 2.1的表达量均显著下调；在丹参萜类途径上选择检测的关健酶基因中，MVA途径上的HMGR1与HMGR2基因表达量均显著下调，而HMGR3基因表达量显著上调；DXP/MEP途径中，DXS1和DXS2基因表达量均显著上调，DXR基因表达量无显著性差异；萜类下游途径中的关健酶基因GPPS、GGPPS1和GGPPS3呈现显著性下调，GGPPS2表达量无显著性变化。 7. 利用HPLC方法检测转基因丹参中脂溶性成分的代谢积累。结果发现，转基因株系中，隐丹参酮与丹参酮ⅡA含量与CK和PDK株系相比均显著下降；二氢丹参酮含量与对照相比无显著性变化