● 摘要
Caˉ(2+)作为细胞内的第二信使，具有重要的生物学功能。而Caˉ(2+)的信使功能 是通过细胞内游离Caˉ(2+)浓度及其分布的时空依赖性变化来实现的，Caˉ(2+)信号的产生 和终止是细胞内Caˉ(2+)增减、波动的结果。因此亚细胞水平Caˉ(2+)含量及其分布变化的 动态监测对于Caˉ(2+)信号传递本质的认识至关重要。其中，细胞核Caˉ(2+)在细胞有丝分 裂、细胞凋亡、基因转录、DNA转录与修复等活动中发挥着重要的调节作用，因 此细胞核Caˉ(2+)的研究对阐明疾病的发病机理及防治具有重要的意义。目前，细胞内 游离Caˉ(2+)的研究主要是用荧光探针标记，然后通过荧光显微成像分析来实现的，在 此探针的性能至关重要，探针若不能区分标记特定亚细胞区域，荧光显微镜也就 根本无法得到有关区域的Caˉ(2+)信息。但迄今为止，还没有可区分性的同时标记胞核 和胞质区域的Caˉ(2+)探针，而常采用将一种探针改性后导入胞核和胞质，这需要对改 性后的探针进行校准，而校准又受到细胞环境的影响，故常无法得到准确的结果， 导致得出相互矛盾的结论，尤其是胞核Caˉ(2+)和胞质Caˉ(2+)的调节机制研究，尚存在争 议。为此，本论文采用我们实验室自行合成的核、质双标的新型Caˉ(2+)荧光探针 STDBT同时标记胞核和胞质，进行了不同激动剂刺激后胞核Caˉ(2+)和胞质Caˉ(2+)的同时 测定，探讨了其调节机制，为细胞胞质、胞核Caˉ(2+)信号转导机制研究提供了有意义 的参考。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1．采用激光共聚焦显微术，应用核、 质双标的新型Caˉ(2+)荧光探针STDBT标记大鼠心肌细胞，探讨了5-HT诱导大鼠心肌 细胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c动员的机理。2．应用双靶向性新型Caˉ(2+)荧光探针STDBT 负载大鼠心肌细胞，结合激光共聚焦显微镜，研究了大鼠心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和胞 质[Caˉ(2+)]_c的调节机制。3．应用新型Caˉ(2+)荧光探针STDBT负载大鼠心肌细胞，结合 激光共聚焦显微镜，在亚细胞水平探讨IGF-1诱导胞质[Caˉ(2+)]_c和胞核[Caˉ(2+)]_n升高的 机制。 本研究论文主要包括以下两个部分： 一．概述 论文对目前报道过的亚细胞区域(如：内质网、线粒体、胞核等)Caˉ(2+)的测定 方法进展和测定研究进展进行了较为详尽的综述。 二．新型Ca2+荧光探针STDBT胞质、胞核钙同时测定研究 1.5-HT诱导大鼠心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c的动员机制研究 利用新型Caˉ(2+)荧光探针STDBT-AM核、质双标的优良性能，结合激光共聚焦 显微镜研究了5-HT诱导大鼠心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c的动员调节机制。 结果表明5-HT通过促进外Caˉ(2+)内流和内Caˉ(2+)释放来使胞质[Caˉ(2+)]_c升高，且5一HT 通过5-HT2受体介导IP3／Caˉ(2+)和DG／PKC双信使途径调节钙池内钙释放，通过L型 钙通道使外Caˉ(2+)内流。而在胞核中除核被膜紧邻外周的肌浆网内Caˉ(2+)释放外，还 可能有核被膜空腔上IP3介导的核Caˉ(2+)库Caˉ(2+)直接释放进入胞核的参与。 2．大鼠心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c的调节机理研究 用新型Caˉ(2+)荧光探针STDBT-AM标记大鼠心肌细胞，结合激光共聚焦技术在 亚细胞水平探讨大鼠心肌细胞受不同激动剂刺激后胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c的变 化。表明在心肌细胞中胞核[Caˉ(2+)]n和胞质[Caˉ(2+)]_c在行使其信使作用时具有相对独 立性，激动剂诱导胞质[Caˉ(2+)]c升高主要来源于外Caˉ(2+)内流和内Caˉ(2+)释放，而胞核 [Caˉ(2+)]_n的升高主要依赖于内Caˉ(2+)释放，即核被膜紧邻外周的内Caˉ(2+)释放和被认为 是核Caˉ(2+)库的核被膜空腔的内Caˉ(2+)释放。 3．IGF-1诱导大鼠心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和胞质[Caˉ(2+)]_c升高的机制研究 用STDBT-AM标记大鼠心肌细胞，研究了IGF-1诱导心肌细胞胞核[Caˉ(2+)]_n和 胞质[Caˉ(2+)]_c升高的机制。结果表明IGF-1升高胞质[Caˉ(2+)]_c主要依赖于外Caˉ(2+)内流和 内Caˉ(2+)释放，而胞核[Caˉ(2+)]_n的升高主要来源于IP3介导的被认为是核Caˉ(2+)库的核被 膜空腔的内Caˉ(2+)释放。