● 摘要
紫杉醇（Taxol）是从红豆杉科红豆杉属植物短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中分离出来具有独特抗癌作用的天然产物。紫杉醇在红豆杉属植物的树皮中含量极低，尽管紫杉醇的全合成已获成功，但合成步骤复杂，成本比天然提取药更高。目前，红豆杉的组织和细胞培养是解决紫杉醇天然资源短缺的有效途径之一。应用组织和细胞培养技术，不仅可以直接生产出紫杉醇，还可以利用这一技术探讨紫杉醇的生物合成途径，实现产业化。防止生态环境和自然资源的破坏，这一研究具有重要的经济价值和社会效益，为扩大高效抗癌药物资源提供了有效途径。 1 南方红豆杉愈伤组织诱导及生长条件的研究 我们对南方红豆杉的组织培养条件进行了试验，主要研究了不同形态的外植体，不同的放置状态、不同种类不同浓度的激素组合对南方红豆杉愈伤组织的诱导、发生性状以及生长量的影响。 研究的结果表明：用作试验的外植体应选1~2年生的具有绿皮的嫩枝，枝条直径以在0.2cm以上为佳。以MS为基本培养基，经添加植物生长激素试验，筛选出最适宜的条件为N3和N5组合，当激素E的浓度超过8mg/L时，对愈伤组织的诱导、生长量择其一指作用；不同浓度的激素A、B、C、D附加在固定浓度激素E的D2组合MS培养基上时，激素A、B、C、D不同程度的抑制愈伤组织的诱导和生长量，抑制的强弱为A>B>C，而激素D则对愈伤组织诱导、生长有促进作用。褐变是红豆杉树植物愈伤组织生长过程中普遍存在的问题。我们通过观察发现，在添加激素A、激素B组合条件下，诱导的愈伤组织褐化速率快，一个月有75%褐化，而附加激素C和激素D的条件下，诱导的愈伤组织褐化速度慢，3个月仅有10%褐化。此外，我们在培养基上附加各种还原剂、吸收剂等；在转移继代过程中把愈伤组织脱离外植体培养；愈伤组织夹碎成为小块平铺于培养基上；缩短继代转移的时间，均未能完全解决这一问题。分别采用蔗糖、葡萄糖、果糖做生理碳源时，对愈伤组织的诱导和生长影响不大，只是在发生状态和褐化程度上有所差异。 2 介质组成对愈伤组织中紫杉醇含量的影响 南方山红豆杉愈伤组织诱导、生长的介质组成不同，组织培养物种紫杉醇的含量有所不同。我们用高效液相色谱对不同介质组成条件下生长的愈伤组织进行了定量分析。测定的结果表明，不同种类不同浓度的激素组合对组织培养物种紫杉醇含量影响不一样。其中以N3或N5两种组合条件下，组织培养物种紫杉醇产率最高，约为外植体所含量的2倍多。我们把愈伤组织的生长于组织培养细胞中紫杉醇含量结合起来分析研究，结果表明，在愈伤组织诱导和生长过程中，紫杉醇的含量随生长速度的加快呈下降趋势。 我们在原有的组织培养基础上，在提高紫杉醇的产率方面也进行了研究，主要采用前体饲喂和诱导子使用技术进行了细胞合成方面的实验，加入前体化合物A、B、C、D、F、G、H，以及化合物E等诱导子。并对加入前体和诱导子的同时也进行了实验，确定在细胞生长的指数期间引入前体和诱导子最为有利。希望通过延长愈伤组织的培养时间来提高紫杉醇的产量是毫无疑义的。前体和诱导子引入对愈伤组织的生长并不产生影响，但可提高紫杉醇产率，最佳的诱导子是化合物E，它能使紫杉醇产率提高3倍多。MS培养基上的愈伤组织紫杉醇产率高于B5培养基上愈伤组织紫杉醇产率；光照条件下培养的愈伤组织细胞所产紫杉醇高于暗室培养；糖的种类不同对紫杉醇产率的影响不大。 3 组织培养物中紫杉醇提取方法的研究 无论是天然的红豆杉植物还是培养的植物细胞组织都必须解决如何提取这个问题。我们试验了回流法和超声法，提取物用量、提取济、提取时间等。实验结果表明，超声法优于回流法。提取物用量少（只需0.2g）,最适宜的提取济为甲醇一氯仿，提取时间仅需10分钟，而且超声提取过程中不会破坏紫杉醇的骨架和侧链结构。 4 HPLC法测定南方红豆杉组织培养物中紫杉醇的含量 实验采用了反相高效液相色谱法，对南方红豆杉组织培养产物中的紫杉醇进行了定量测定。再C18柱上（5um,5mm150mm），流动相为含3%四氢呋喃和7%乙腈的甲醇一水（3：1，V/V）体系，波长254nm下检测。采用外标法定量，测得紫杉醇在0.04~0.8mg/L范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=3810X—448；回收率在98.2%~101.6%之间。本方法不仅可用于测定组织培养物中紫杉醇含量，还可用于测定外植体中紫杉醇的含量。分离速度快，一次近样3分钟就可测出紫杉醇含量；流动相流速低，降低了检测成本；流动相脱洗能力强，且能获得更短的分析周期和较低柱压。
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