题目：中国林蛙催乳素及其受体的克隆、序列分析和变态期间的表达模式鉴定

为了探讨催乳素（prolactin，PRL）和催乳素受体（prolactin receptor，PRLR）在两栖动物变态过程中发挥的作用，本研究首先对中国林蛙（Rana chensinensis）的 PRL 以及 PRLR 的 cDNA 进行了克隆鉴定，并分别检测了 PRL 在脑的表达以及PRLR 在肝、尾、皮、肾中的表达，进一步分析了二者在林蛙变态过程中担负的角
色。 
1.所获得的 PRL cDNA 由 645-bp 的开放阅读框（open reading frame，OPF）构成，由之推导的多肽序列共编码 214 个氨基酸(amino acid，aa)残基。经 SignalP 预测，其包含 27 aa 的信号肽序列。分子量为 24313.6 Da，pI 为 6.07；另外，所获得的 PRLR  cDNA 由 29-bp 的 5′-UTR，237-bp 的 3′-UTR 以及 1854-bp 的 ORF 构成，由之推导的多肽序列共编码 617 个氨基酸残基。经 SignalP 预测，其包含 26  aa 的信号肽序列。分子量为 69298.6  Da，pI 为 5.59。进而对 PRLR 多肽序列进行跨膜域检测发现，其包含 22  aa 的单次跨膜域，因而 PRLR 多肽被划分为胞外域（extracellular domain，ECD），跨膜域（transmembrane domain，TMD）和胞内域
（intracellular domain，ICD）三部分。 
2.多肽序列比对结果表明，rcPRL 包含 3 对保守的 Cys 残基。然而，由于第1对 Cys 残基位于信号肽序列内，其在蛋白成熟过程中被去除。因此，只有第 2、3对形成两个二硫键。此外，后两对 Cys 残基的相对位置在脊椎动物中也是高度保守的。二级结构预测表明，rcPRL 包含 4 个 α 螺旋。比对结果还显示，rcPRL 含有两个保守的基序，即 motif 1 和 motif 2。二者分别由 34 aa 和 18 aa 构成；在rcPRLR中，同样发现了一些保守的基序，包括两对保守的 Cys 残基（site  38，48，77 和88），WS motif，三个潜在的 N-糖基化位点（site 61，114 和 134），以及 Box 1和 Box 2。所有这些特点都与哺乳动物的长型 PRLR 一致。相比较而言，PRLR 的
ECD比 ICD更为保守：在各物种间，ECD 的一致性为 48-92%，而 ICD 则为 38-95%。 
3.对 rcPRL 和其他脊椎动物 PRL 间的亲缘关系，以及 rcPRLR 和其他脊椎动物 PRLR 间的亲缘关系对比后，结果表明两者间的一致性关系基本一致：rcPRL 与两栖类、鸟类和爬行类、哺乳类的一致性分别为 80-97%、70-75%、48-73%，rcPRLR与两栖类、鸟类和爬行类、哺乳类的一致性分别为 53-94%、44-47%、42-47%。这意味着在中国林蛙，rcPRL 与 rcPRLR 可能是协同进化的。

4.除中国林蛙及其他无尾两栖类外，在有尾两栖类，爬行类，鸟类和哺乳类当中都发现了一个保守的 His 残基，而此残基与 pH 依赖性受体识别紧密相关，这表明包括林蛙在内的无尾两栖类的 PRLR 识别过程可能并非是 pH 依赖性的。 

5.除 Trichosurus vulpecula 和 Myotis davidii 外，包括中国林蛙在内的绝大多数物种中均发现了 DSGRGS motif。研究表明此基序与长型 PRLR 的泛素依赖性降解息息相关。这表明 rcPRLR 的降解可能也是泛素依赖性的。 
6.通过 RT-PCR 技术检测了 rcPRL 和 rcPRLR mRNA 的表达模式。从预变态期至变态后期（41-46 期），rcPRL 在脑中持续表达，并呈现出不断增强的趋势。rcPRLR在肝脏中的表达整体而言较为微弱，但在变态高峰期迅速增强，表明在变态前期肝脏不是 PRL 的主要靶器官；rcPRLR 在皮肤和尾中持续高表达，这可能是因为其参与了皮肤的渗透调节和尾的退化吸收过程；而 rcPRLR 在肾脏中的变化趋势则可能与肾脏的变态过程有关。总而言之，rcPRL 和 rcPRLR 的表达模式均支持了“在两栖动物变态过程中 PRL 的作用并不类似于 JH（juvenile hormone）”这一观点。