题目：淫羊藿总生物碱的测定、提取及其对金黄色葡萄球菌的抑制作用

摘 要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起食源性疾病的主要微生物之一。开发新型金黄色葡萄球菌抑菌剂，消除食品中的金黄色葡萄球菌污染，是食品安全研究的重要课题。淫羊藿（Epimedium）是我国著名的药食两用植物，在食品、医药工业中具有广泛用途。淫羊藿生物碱具有抑菌活性，是淫羊藿重要的功能因子。本文对淫羊藿总生物碱的测定、提取及其对食源性金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了系统研究，主要得到以下结论：

（1）优化了淫羊藿生物碱的样品制备工艺，建立了一种精确、灵敏、特异测定淫羊藿生物碱含量的紫外分光光度法，并采用该方法测定了陕西省市售淫羊藿中生物碱的含量。通过单因素试验和正交试验得到的淫羊藿生物碱最佳水浴提取工艺条件为：提取温度70℃，料液比1:50，提取次数3次。选择木兰花碱作为比色标准品进行定量分析，测定波长为268nm；在8.00-24.00μg/mL范围时，生物碱浓度与吸光度线性关系良好（R2=0.9982）；检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.10μg/mL和0.30μg/mL；平均回收率为104.81%；日间、日内精密度分别在0.04%-0.09%和0.03%-0.11%之间；样品溶液在24h内具有较高的稳定性。测定发现陕西省不同地区淫羊藿样品中生物碱含量变异较大。

（2）建立了淫羊藿总生物碱的超声辅助提取工艺。通过对影响淫羊藿总生物碱提取率的单因素进行试验，并通过正交试验对影响因素进行工艺优化。最终得到淫羊藿总生物碱超声辅助提取技术乙醇溶剂提取制备工艺的最佳工艺参数为：浸泡时间为35min，提取液固比为1:35，超声频率为130kHz，超声时间为35min，超声温度40℃。并与传统（水浴浸提和振荡提取）方法的淫羊藿总生物碱的提取率进行比较，验证了超声辅助提取可以显著提高提取率。在此基础上，采用高效液相色谱法对淫羊藿总生物碱的化学组成进行初步探索，色谱结果显示淫羊藿总生物碱提取物中含有一定量的木兰花碱，但是提取物的化学成分组成较为复杂，有待于下一步的分离鉴定。

（3）采用试管二倍稀释法测定淫羊藿生物碱对供试菌株的抑菌活性进行研究。淫羊藿总生物碱样品溶液是通过真空冷冻干燥后的粉末经无菌水溶解后得到。通过淫羊藿总生物碱粗提取物对各微生物进行体外抑菌性试验得出：淫羊藿总生物碱对细菌有相对显著的抑菌活性，对真菌中的酵母菌有抑菌活性但效果不理想，对真菌中的霉菌几乎没有抑菌活性。淫羊藿总生物碱粗提取物对细菌中以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌显示出较强的抑菌活性，最小抑菌浓度约为45.03mg/mL，抑菌圈大小约为12mm。

（4）以金黄色葡萄球菌作为淫羊藿总生物提取物抑菌机理探究的目标菌种，探究对金黄色葡萄球菌生长变化、胞内外可溶性蛋白、胞内核酸量、电导率变化，离子量变化的影响。试验得出：淫羊藿总生物碱粗提物可明显的增加菌体胞外蛋白的量；试验菌株的电导率比对照有了显著增加；试验菌种菌体核酸含量的增加；试验菌种胞内的离子流出使得胞外离子量增加；试验菌种生长到对数生长期时加入淫羊藿总生物碱粗提物，菌体数目显著减少。并通过扫描电镜观察微观条件下细胞物理变化进一步探究淫羊藿总生物碱粗提物的抑菌机理，得出淫羊藿总生物碱粗提物可能是改变了金黄色葡萄球菌的细胞膜的通透性，破坏了其细胞膜结构从而起到抑菌作用。

 

关键词：淫羊藿生物碱；金黄色葡萄球菌；定量分析方法；超声辅助提取；抑菌；抑菌机理