题目：携带环脂肽NRPS基因的荧光性假单胞菌菌种资源库的建立及多态性研究

环脂肽（cyclic lipopeptid）类抗生素具有两亲性，属于一种生物表面活性剂，在化学结构以及作用机制方面，与之前发现的所有种类的抗生素都有所不同。环脂肽类抗生素家族的产品在临床上的显著优势，以及其全新的结构类型, 使得环脂肽类化合物成为当今新抗生素筛选的热点。

荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescent）是环脂肽抗生素产生菌的极好来源。荧光假单胞菌所产的环脂肽是利用巯基化模块由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）合成。环脂肽线性NRPS合成模块的共同特点为：第一个模块除含有C，A和PCP结构域外，还含有一个C1结构域，负责将第一个氨基酸酰化，使寡肽链和脂链相连；无差向异构(epimerization, E) 结构域，由其特有的C/E 结构域负责将L-氨基酸转化成D-氨基酸；C端有两个硫酯酶 (thioesterase, Te)结构域，催化成熟肽链环化和释放。

本文在环脂肽NRPS C1保守区设计了一对引物，Te保守区设计了两对引物，通过PCR扩增的方法，从陕西和福建两地的土样中共筛选到了大约100株携带有环脂肽NRPS基因的荧光假单胞菌菌株，建立了携带有环脂肽NRPS基因的荧光假单胞菌菌种资源库。之后，利用DGGE方法对所得菌种的16S rDNA V3 区进行了多态性分析。同时，分别运用SSCP、酶切分型等方法对荧光假单胞菌环脂肽NRPS基因进行了多态性分析。主要内容与结果如下：

1，利用荧光假单胞菌菌落在366 nm紫外线照射下产生荧光的特点，从陕西的根际土壤样品中筛选到荧光假单胞菌1000多株，从福建境内的根际土壤样品中筛选到荧光假单胞菌400多株。通过排油圈实验，从陕西的1000多株荧光假单胞菌中筛选到产表面活性剂的96株，从福建的400多株荧光假单胞菌中筛选到产表面活性剂的菌株87株。

 2，通过PCR的方法，从陕西的96株产表面活性剂的荧光假单胞菌中，筛选到48株携带有环脂肽NRPS基因的菌株；从福建的87株产表面活性剂的荧光假单胞菌中，筛选到42株携带有环脂肽NRPS基因的菌株。

3，利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法，对两地荧光假单胞菌菌种的16S rDNA V3区进行多态性分析，比较两地菌种的多样性。结果显示两地的菌株种类相同，但是每个种类包含的样品数有差异。

 

4，对环脂肽NRPS基因C1区和Te区进行SSCP多态性分析，比较陕西福建两地菌株所携带环脂肽NRPS基因的多态性。结果显示两地不同的样品经电泳后所得的条带数有3，5，7三种情况，且条带位置有差异。

5，用两种不同的限制性内切酶HinfⅠ和SphⅠ对环脂肽NRPS基因Te区进行酶切。HinfⅠ酶切后得到5种带型，SphⅠ酶切后得到4种带型。

本研究发现，本实验所建立的PCR筛选方法能够高效、经济的筛选到携带有环脂肽NRPS基因的荧光假单胞菌，所建立的菌种资源库为发现新型环脂肽奠定了物质基础。在后续工作中，将会从活性物质的分离与鉴定出发，利用HPLC方法对荧光假单胞菌产生的生物表面活性剂进行分类鉴定。进一步纯化不同种类样品，通过质谱、红外色谱、核磁共振和氨基酸组成手型分析等，确定环脂肽类抗生素的结构。同时可以对实验中分离到的环脂肽NRPS基因片段进行测序，通过生物信息学手段预测荧光假单胞菌菌株产新型脂肽类抗生素能力。总之，本实验为进一步建立产环脂肽类抗生素假单胞菌菌种资源库以及确定具有产新型脂肽类抗生素能力的菌株奠定了基础。