● 摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草属多年生草本药用植物，在中国广泛栽培，中药丹参在临床上被广泛用于心脑血管疾病和各种炎症的治疗等。目前，由于丹参野生资源破坏日益严重，药用需求日益加大，因此对于丹参质量研究日趋受到重视。随着分子生物学实验技术的进步与发展，对于丹参分子生物学的研究也逐渐展开，丹参基因功能研究平台也逐渐被搭建，这为研究丹参的次生代谢和生物量相关基因奠定了基础。本研究在早期建立的丹参EST数据库中，筛选出了一条高丰度表达的未知基因SmSRP，对该未知基因的表达及调控特征进行研究。结合拟南芥同源基因AT2G17350的生物信息，并通过over-expression和RNAi基因等实验手段，获得一系列丹参和拟南芥转基因植株，并对转基因株系和突变体进行表型分析和总蛋白测定，同时结合酵母双杂交和BiFC的方法，初步阐明该未知基因在丹参和拟南芥的功能，为该未知基因的功能进一步研究提供了依据和奠定了基础。具体研究内容如下：
1. 通过对丹参逆境胁迫的EST数据库中表达丰度的分析，获得了含有376个拷贝，占库中比例3.33 %的一条序列，暂命名为SmSRP（Salvia miltiorrhiza stress-response protein）。序列比对结果发现该基因在植物中普遍存在，但其在所有物种中功能均未知。SmSRP基因具有两个内含子，拟南芥同源基因AT2G17350仅有一个内含子。ORF共编码117个氨基酸，富含精氨酸，谷氨酸和赖氨酸等酸碱性氨基酸。丹参SRP和AT2G17350均能通过原核表达的方法表达完整蛋白，该蛋白不具信号肽，没有膜锚定或跨膜结构域，没有miRNA预测位点，α-螺旋为其主要的二级结构，占72.65 %。
2. 利用实时荧光定量PCR分析SmSRP的表达和调控，发现SmSRP显著响应各种生物或非生物胁迫，短时间内，低温和脱水等均能刺激该基因表达上调，长时间胁迫下其基因表达受到抑制，SmSRP不存在节律响应，但对于长时间黑暗和高温持续积极响应。丹参中种子萌发初期大量表达，后期在子叶中大量表达，不同组织中叶的表达量最高。同样在拟南芥该同源基因AT2G17350的实时荧光定量PCR分析也验证了此结论，与在线数据库结果相一致，AT2G17350在种子萌发和胚形成过程中大量表达，其在子叶和花结构中表达量最高，但不显著响应各种胁迫。
3. 通过DNA Walking的方法克隆获得了SmSRP基因的5’侧翼序列，通过网上数据库获得了拟南芥AT2G17350的启动子序列，通过在线软件分析了其顺式作用元件，发现在丹参中存在4个胚乳特异性响应元件和部分非生物源胁迫相关的顺式作用元件和激素应答元件，而拟南芥中仅有一个胚乳响应元件和少量激素应答元件。通过删减启动子转化丹参分析发现在丹参启动子中序列越长，GUS活性越高。通过转化拟南芥分析发现：该基因启动子在花中表达量最高，在花托、雌蕊花柱和雄蕊花丝、花粉和其他组织嫩叶、芽中表达量尤为显著。
4. 通过农杆菌介导的转基因方法获得丹参SmSRP基因 RNAi植株，移栽温室180天地上部分生物量明显小于WT，地下部分二者差异不大，但地上部分总蛋白含量显著减少。而在拟南芥突变体中研究发现，该基因突变体无法获得纯合体植株。后期杂合体自交产生的后代中杂合体：WT分离比稍小于2：1，杂合体没有明显的表型差异，但总蛋白含量减少。通过在拟南芥中过表达和RNAi该基因，发现转基因植株T1代表型没有显著差异，但是过表达植株中总蛋白含量增加，RNAi植株中总蛋白含量减少。
5. 通过酵母双杂交实验发现，拟南芥同源基因AT2G17350编码蛋白与AT3G25980（MAD2，纺锤体装配检验点蛋白），AT4G02150（一种蛋白转运和绑类蛋白质IMPA-3），AT4G16143（IMPA-2），AT5G65940（CHY，3-羟异丁酰-CoA水解酶）可能具有相互作用，通过BiFC证实我们的实验结果。而突变体实验进一步证明AT2G17350与四个基因信号通路作用方式各有不同。根据以上结果，我们推测拟南芥AT2G17350编码蛋白通过影响在胚发育等过程中细胞的有丝分裂和减数分裂，以及与CoA相关能量ATP的水解和还原等，或影响某些蛋白的转运或绑定等来改变对拟南芥生长发育。