● 摘要
甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)为我国西北黄土高原特有的哺乳动物，终身营严格的地下洞道生活，生活环境低O2高CO2，长期地下生活，使其形成了一系列的独特适应机制，是研究低氧适应机制的理想模式动物。研究表明，甘肃鼢鼠通过红细胞增殖及血红蛋白的大量合成来提高血液载氧能力，减少低氧伤害，红细胞生成主要受促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的调控，EPO通过刺激骨造血功能，增加红细胞数量从而提高血液携氧能力和增强机体对氧的利用，提高低氧耐受，而低氧是促进EPO生成的重要因素。Shams等(2004)对盲鼹鼠(Spalax) EPO和低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的研究表明，地下鼠在基因水平也表现出对地下低氧环境的适应。近年研究也发现，中枢神经系统中也有EPO及其受体的表达，具有多种神经保护作用，神经元的许多功能受EPO调控，EPO已经被认为是中枢神经系统一个新的信号转导分子。
本论文以甘肃鼢鼠为研究对象，通过实时定量RT-PCR方法对EPO基因在甘肃鼢鼠和SD鼠脑组织的mRNA表达水平进行相对定量研究；通过RT-PCR技术克隆甘肃鼢鼠EPO基因的全长cDNA序列；通过生物信息学方法对获得的EPO蛋白序列进行分析。研究结果如下：
1.采用荧光实时定量RT-PCR法对甘肃鼢鼠和SD大鼠脑组织不同低氧条件下EPO mRNA表达水平进行相对定量分析。结果显示，甘肃鼢鼠脑组织EPO mRNA常氧条件下的表达量最低，急性低氧表达水平显著增加，间歇慢性低氧较急性低氧显著下降，但高于常氧；SD大鼠常氧表达量最低，急性低氧表达水平相对常氧极显著增加，间歇慢性低氧条件下表达水平相对急性低氧极显著增加。说明甘肃鼢鼠EPO表达受低氧影响较小，具有良好的低氧耐受力，对低氧刺激不敏感，能通过快速反馈机制维持机体在低氧环境下的正常生理功能。由此推断，甘肃鼢鼠比SD大鼠更能有效调动机体的反馈机制适应低氧。由于EPO在中枢神经系统具有多种神经保护作用，甘肃鼢鼠比SD大鼠更适应低氧进而减少低氧对脑组织的损伤，这对我们研究EPO在脑组织中作用的分子机制奠定了基础，它们之间表达的不同，可能是因为EPO分子结构的不同。
2.甘肃鼢鼠EPO基因cDNA序列全长为579bP片段，与高原鼢鼠 (Eospalax baileyi)EPO基因的cDNA序列同源性达99%。因此，确定该序列为甘肃鼢鼠EPO基因的cDNA序列。通过开放阅读框查找工具(ORF Finder)预测开放阅读框，其包含一个长度579bP的开放阅读框，共编码192个氨基酸残基。因此，确定该cDNA序列为EPO基因的全长cDNA序列，能编码一个完整的EPO蛋白质序列，可进行后续实验及数据分析。
3.生物信息学分析EPO蛋白序列。理化性质分析显示，EPO的相对分子量为21357.8Da，理论等电点pl=7.64，分子式为C960 H1543 N257O276S8，信号肽分析显示，该蛋白具有信号肽位点，说明该蛋白属于分泌型蛋白；对该蛋白功能基序进行分析，发现该蛋白序列具有多个功能位点，主要包括3个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个细胞附着序列位点和1个促红细胞生成素/促血小板生成素信号位点；二级结构分析表明，EPO属于all-alpha型；三级结构分析结果表明，与EPO蛋白最匹配的模板是1buyA，最佳比对区域位于EPO蛋白序列的第27-192位氨基酸残基，序列一致性达80.12%，e值为4.54e-70。EPO的空间构象由4个α-螺旋束（HelixA，HelixB，HelixC，HelixD）和连接它们的3个环肽链结(LoopAB，LoopBC，LoopCD)组成。
ClustalX同源性对比结果表明，甘肃鼢鼠EPO氨基酸序列与高原鼢鼠、以色列盲鼹鼠等地下鼠同源性最高，与仓鼠、根田鼠、人等的同源性较低；虽然甘肃鼢鼠、高原鼢鼠属于鼢鼠亚科，四种盲鼹鼠属于鼹形鼠亚科，但EPO进化树表明，这两亚科的地下鼠最后聚同于同一分支，遗传距离图和分子进化树显示，甘肃鼢鼠与高原鼢鼠、盲鼹鼠之间遗传距离最小、进化关系最近，与人进化关系最远。
地下鼠和地面鼠EPO基因功能分化分析表明，他们的EPO基因发生了功能分化，共有29位后验概率值超过0.80的氨基酸功能分化位点，有2位(117Leu，161Val)后验概率值超过0.90的功能分化决定位点。甘肃鼢鼠基因选择压力分析表明，EPO基因在进化中主要受到纯化选择以及中性选择，在进化中高度保守。位点模型检测出了3个受正选择作用的氨基酸位点，分别为第11位的亮氨酸、第144位的丙氨酸和152位的脯氨酸(11Leu，144 Ala，152Pro)。
从地下鼠和地面鼠EPO基因功能分化及选择压力分析可以看出，地下鼠和地面鼠在漫长的进化过程中，一些氨基酸位点发生了功能分化及正选择适应。EPO基因这些氨基酸位点是对地下低氧共同生态位的趋同进化，可能是对严酷地下低氧环境适应的分子机制之一，这为研究低氧适应哺乳动物EPO基因的功能提供了参考，便于进一步研究其结构与功能的关系及对缺氧的适应与耐受，为临床医学、航天医学、运动医学以及缺氧引起的相关疾病的基础研究和治疗等方面提供理论依据。
关键词 甘肃鼢鼠，EPO，克隆，实时定量RT-PCR
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