● 摘要
本文以蚕豆和拟南芥为材料，借助气孔试验、激光共聚焦显微镜技术、高效液相色谱技术，研究了鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、植物鞘氨醇-1-磷酸（Phyto-S1P）和胞质pH在暗诱导气孔关闭中的作用及其与H2O2和NO的关系。所得实验结果主要如下：
1. 暗明显诱导蚕豆保卫细胞胞质pH、H2O2和NO水平升高且引起气孔关闭，弱酸丁酸、H2O2调节剂（H2O2清除剂ASA、H2O2清除酶CAT、H2O2产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI）和NO调节剂（NO清除剂cPTIO、NO合酶抑制剂L-NAME）分别显著抑制上述暗效应，显示胞质碱化、H2O2和NO均参与暗诱导气孔关闭。暗处理10 min胞质pH即显著升高， 20 min 时H2O2和NO水平才迅速升高，光下甲胺显著提高H2O2和NO水平，暗中丁酸显著降低H2O2和NO水平，显示胞质碱化是H2O2和NO产生的诱导因素。ASA、CAT和DPI明显抑制甲胺触发的NO产生，cPTIO和L-NAME明显抑制甲胺诱导的H2O2产生，显示H2O2介导甲胺触发的NO产生，NO介导甲胺诱导的H2O2产生。胞外和胞内钙螯合剂BAPTA、 BAPTA-AM显著阻止暗诱导胞质碱化、H2O2、NO产生和气孔关闭，显示钙通过诱导胞质碱化、H2O2和NO产生调节暗诱导气孔关闭。
2. 暗明显诱导蚕豆S1P和H2O2水平提高且促进气孔关闭，长链碱基激酶抑制剂DL-threo-二氢鞘氨醇（DL-threo-DHS）和N, N-二甲基鞘氨醇（DMS）显著抑制这些暗效应，外源S1P明显诱导气孔关闭和H2O2产生，ASA、CAT和DPI显著抑制S1P的这些效应，显示S1P合成通过触发保卫细胞H2O2产生介导暗诱导气孔关闭。DL-threo-DHS和DMS显著抑制暗诱导保卫细胞胞质碱化和气孔关闭，外源S1P明显诱导保卫细胞胞质碱化和气孔关闭，丁酸明显降低外源S1P的这些效应，显示S1P合成通过诱导胞质碱化介导暗诱导气孔关闭。此外，丁酸明显抑制暗诱导H2O2产生，结合前述S1P通过诱导胞质碱化和H2O2产生调节暗诱导气孔关闭的结果，能够得出S1P引起的胞质碱化是H2O2产生的先决条件的结论。外源S1P处理后保卫细胞胞质pH升高较H2O2增加滞后期短且更早达到峰值以及丁酸显著抑制S1P诱导H2O2产生也支持这一结论。
3. 暗明显诱导蚕豆S1P和NO水平提高且促进气孔关闭，DL-threo-DHS和DMS显著抑制这些暗效应，外源S1P明显诱导气孔关闭和NO产生，cPTIO和L-NAME显著抑制S1P的这些效应，显示S1P合成通过触发保卫细胞NO产生介导暗诱导气孔关闭。DL-threo-DHS和DMS显著抑制暗诱导保卫细胞胞质碱化和气孔关闭，外源S1P明显诱导保卫细胞胞质碱化和气孔关闭，丁酸明显降低外源S1P的这些效应，显示S1P合成通过诱导胞质碱化介导暗诱导气孔关闭。此外，丁酸明显抑制暗诱导NO产生，结合前述S1P通过诱导胞质碱化和NO产生调节暗诱导气孔关闭的结果，能够得出S1P引起的胞质碱化是NO产生的先决条件的结论。外源S1P处理后保卫细胞胞质pH升高较NO增加滞后期短且更早达到峰值以及丁酸显著抑制S1P诱导NO产生也支持这一结论。
4. DL-threo-DHS、DMS和SPHK1突变显著抑制暗诱导拟南芥气孔关闭，这些效应可被Phyto-S1P逆转，显示Phyto-S1P参与暗诱导拟南芥气孔关闭。DPI和AtRbohF、AtRbohD/F突变显著抑制、AtRbohD突变不抑制暗诱导拟南芥气孔关闭和H2O2产生，显示AtrbohF催化产生的H2O2参与暗诱导拟南芥气孔关闭。L-NAME、硝酸还原酶（NR）抑制剂Na2WO4和AtNOA1、Nia1、Nia1Nia2突变显著抑制、Nia2突变不抑制暗诱导拟南芥气孔关闭和NO产生，显示暗诱导拟南芥气孔关闭过程中的NO产生依赖于Nia1途径与AtNOA1途径。
5. 外源H2O2和SNP显著逆转DL-threo-DHS、DMS和SPHK1突变抑制暗诱导气孔关闭的效应，但Phyto-S1P不能逆转ASA、CAT和cPTIO抑制暗诱导气孔关闭的效应，而且DL- threo-DHS、DMS和SPHK1突变显著抑制暗诱导H2O2和NO产生。这些结果表明Phyto-S1P通过触发保卫细胞H2O2和NO产生介导暗诱导拟南芥气孔关闭。另外，ASA、CAT、DPI和AtRbohF、AtRbohD/F突变显著阻止、AtRbohD突变不阻止外源Phyto-S1P诱导气孔关闭及H2O2产生，cPTIO、L-NAME、Na2WO4和AtNOA1、Nia1、Nia1Nia2突变显著阻止、Nia2突变不阻止外源Phyto-S1P诱导气孔关闭及NO产生。这些结果进一步证明Phyto-S1P通过触发保卫细胞H2O2和NO产生介导暗诱导拟南芥气孔关闭，Phyto-S1P诱导的H2O2产生由AtrbohF催化，NO产生依赖于Nia1途径和AtNOA1途径。
综上所述，本文的结果表明暗提高了蚕豆叶片S1P含量和保卫细胞胞内钙水平，因而引起了胞质碱化，最终诱导H2O2、NO产生和气孔关闭。另外，Phyto-S1P介导的暗诱导拟南芥气孔关闭中H2O2的产生依赖于AtrbohF，NO的产生依赖于Nia1途径和AtNOA1途径。