● 摘要
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)由于其染色体数目少、次生代谢产物种 类多、具有重要药用价值等特点，其分子生物学研究倍受青睐。本文以组织培养 的丹参幼苗为材料，构建丹参cDNA文库并进行大规模EST序列分析，开展丹参外 源基因高频转化体系的研究，为丹参功能基因组研究奠定基础。主要研究结果如 下： 1．通过对尿素法、CTAB法、苯酚法、热硼酸改良法、异硫氢酸胍法丹参RNA 提取质量的比较，在异硫氢酸胍法的基础上，加入10～20％的低浓度乙醇沉淀多糖 及次生代谢物，建立了丹参高质量总RNA的提取方法。提取的RNA OD_260/280为 2.03(±0.04)，得率为100 μg/g新鲜材料，为丹参的基因克隆、cDNA文库构建、 Northern blotting分析等研究奠定基础。 2．利用Invitrogen的pBluescript IIˉXR cDNA library construction kit构建丹参 cDNA plasmid文库，通过平板菌落统计计算库容为1.2×10ˉ5，推算对取材时期丹 参表达基因的覆盖倍数为1O倍以上，具有良好的覆盖率，适合进行取材时期基因 表达谱、EST分析等后续研究。 3．随机挑选12,056个cDNA克隆进行5’端的大规模序列分析，测序成功率 89.5％。利用mass editing程序(http：∥WWW．mrc-lmb．cam．ac．uk/punseq/manual/pregap4 _unix_toc．html)去载体、接头以及低质量序列或较短的序列。获得了有效EST序列 (Read length≥100bp)9,664个，序列平均长度为41lbp。 4．通过EST Analysis Pipeline SystemˉTM Program对9,664条有效EST进行序列 拼接和组装，得到1,492个重叠群(Contigs)和3,545个单拷贝EST(Singletons)， 共计获得5,037个独立基因(Unigenes)，其中单拷贝基因占到73.9％。 5．分别利用NCBI的Blastn、Blastx以及SWISS-PROT的Blastx工具对基因 进行功能注释，分别有1,055,3,428,1,615条基因得到了注释，完全没有注释的 基因有1594条，占获得基因总数的31.6％。 6．利用“GO”分类分析，对所注释的基因从细胞组成、分子功能和生物过程 三个方面进行了分类分析。分别有3,130、4,229、和4,789个基因被归类到细胞组 成、分子功能和生物过程分枝中。 7．利用“PATHWAY” 分析对涉及代谢过程的2,689个基因进行了代谢途径 分析并对其在KEGG代谢图谱中的位置进行了标示。所有基因共涉及607条代谢 相关的酶，可归入11个大的代谢途径，其中归类到糖类代谢、氨基酸代谢、辅酶 和辅因子代谢以及外源物质生物降解途径中的酶较多，这可能与所取材料处于异 养状态有关。 8．通过“Digital Northern”分析，说明本研究所建立的文库中与生长发育相关 的基因如生长素诱导蛋白基因、茎特异蛋白基因和逆境胁迫相关的基因如胚胎发 育后期丰富蛋白基因、水通道蛋白基因、硫素蛋白基因、病程相关蛋白基因等得 到了超丰度表达，这类基因的EST数占到总EST数的9.77％，该结果与实验选材 特征基本一致。 9．初步筛选影响了丹参农杆菌转化体系的因素，确定了丹参农杆菌转化的基 本程序：试管苗茎尖在MS培养基上继代培养10d，切取叶片切块预培养ld，过 夜培养农杆菌菌株至OD_6000.8～1.O，离心收集菌体用MS液体培养基稀释至 OD_6000.4，浸染25 min，共培养3d，芽诱导选择培养2次，每次10d，然后生根 选择2次，每次15d，最后在MS基本培养基上生根和继代培养。其中预培养、 共培养、芽诱导培养培养基为MS附加BAP4.4 μmol·1ˉ-1和NAAO.5 μmol·1ˉ-1，生根 选择及生根和继代培养基为不含激素的MS基本培养基。芽诱导选择及生根选择 过程选择压均为卡那霉素60 mg·1ˉ-1，抑菌素为头孢霉素200 mg·1ˉ-1。 1O．通过转化共获得抗性芽71株，经PCR，Southern blotting和GUS活性检 测表明转化率为79.4％。 本研究为丹参功能基因组研究和遗传操作研究奠定了较好的基础。