● 摘要
γ-聚谷氨酸(γ-poly glumatic acid, γ-PGA)是微生物发酵产生的一种大分子多肽，具有可降解性、成膜性、保湿性及可食性等特点，在食品、化妆品、医药等工业领域具有广泛的应用前景。本课题组前期利用氯化钙对一株γ-PGA 产生菌Bacillus subtilis natto HSF1410进行发酵调控，使得γ-PGA产量提升,发酵液的粘度降低，并且不引起其分子量变化。在研究钙离子调节γ-PGA合成的机理时发现钙离子可提升菌体内α-酮戊二酸节点处的谷氨酸脱氢酶基因的转录水平，使该酶表达量增加。此外,该节点处α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)的活性也随着钙离子添加而增加。
为完成α-酮戊二酸节点的全景分析，深入研究聚谷氨酸合成的调控机理，本文以HSF1410菌株中α-酮戊二酸脱氢酶以及聚谷氨酸合成酶（PgsB）为对象, 研究钙离子对酶活的胞内、外调节作用及对两个酶的编码基因ogdh和pgsB的表达丰度的影响，并分析聚谷氨酸产量、NH4Cl消耗量和生物量的变化，以深刻探究钙离子调控聚谷氨酸合成的机制。
此外，为了从分子水平进一步研究聚谷氨酸合成途径与调节机制，我们对HSF1410菌株进行了全基因组测序，并且对结果进行了Non-coding RNA 注释、基因功能注释等信息分析；根据已获取的 pgsBCA和16s rRNA基因序列构建了系统进化树对谷氨酸依赖菌和非依赖菌进行聚类分析。获得的主要研究结果如下：
（1）从胞外激活和胞内调节的角度，研究了钙离子对OGDH的调节作用。实验结果表明钙离子对OGDH没有胞外的直接激活作用；于培养基中添加不同浓度的氯化钙对HSF1410进行发酵，利用实时定量PCR技术测定ogdh转录水平，结果表明：当钙离子浓度从0升高到0.2‰，ogdh的表达丰度增大至原来的4.518倍，OGDH比酶活增大至原来的3.2倍。我们认为钙离子通过调节ogdh的转录水平使得OGDH酶活提高，进而增加了TCA循环中的代谢通量，更多的碳源、氮源流向谷氨酸合成方向，因此在一定程度上促进了γ-PGA的合成。
（2）从基因转录水平的层面探究了钙离子对PgsB的调节作用。当钙离子浓度从0升高到0.2‰，pgsB的表达丰度增大至原来的1.76倍。由于PgsB催化γ-PGA 链中谷氨酸的加入，因此可推测钙离子通过提高pgsB的转录水平进而对γ-PGA合成进行调节。
（3）考察了钙离子对HSF1410发酵过程中菌体生长情况、γ-PGA产量及底物NH4Cl消耗量的影响。实验发现随着钙离子浓度升高，发酵液中生物量逐渐降低。当CaCl2浓度为0.1‰时，γ-PGA产量（8.55g/l）、底物谷氨酸钠转化率（0.428）及底物NH4Cl消耗量（0.698g/l）可达最高值。以上结果表明，钙离子可抑制菌体的生长，且CaCl2最佳添加量为0.1‰（w/v）。
（4）利用高通量测序技术对Bacillus subtilis HSF1410进行全基因组测序。基因组总长度约为4.18Mb,序列GC含量比为43.26%。采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列，翻译后得到预测基因的蛋白序列，与KEGG、COG、GO蛋白库进行比对，获得基因对应蛋白质的功能注释信息。
（5）以16s rRNA和pgsBCA序列构建的系统发育树均可将谷氨酸依赖菌和非依赖菌分别聚类，说明这两种聚谷氨酸产生菌不仅在发酵方式上存在差异，在16s rRNA和pgsBCA序列上也表现出不同的亲缘关系。
综上，本文初步阐明Ca2+可通过调控ogdh和pgsB的mRNA转录水平以调节聚谷氨酸的产量，为下一步从分子生物的角度深入研究聚谷氨酸合成途径与调节机制提供思路。此外，本文提供了HSF1410的全基因组信息并获取了γ-PGA合成中相关基因的信息，以便建立分子操作体系并进行深入的分子水平的机理研究，为后续构建聚谷氨酸高产量的工程菌株奠定理论基础。