● 摘要
医学免疫分析分为体液免疫分析和细胞免疫分析两大部分。体液免疫分析是测定体液中游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质，如病毒，细菌等；细胞免疫分析则是测定细胞膜表面的特异性蛋白或侵入到寄主细胞内的病毒、胞内寄生菌或外来的组织团块、癌变的细胞等。免疫分析要求高亲合力、高特异性和超高灵敏度检测。为了实现这一目标，本论文研究用细胞融合技术制备高亲合力和特异性的单克隆抗体，用高量子产率的荧光纳米粒子作标记物，和用荧光显微成像；激光诱导荧光阵列分析和化学发光阵列分析进行检测。用以上研究制备的纳米粒子免疫传感器已经成功地用于结肠癌细胞、7721肝癌细胞及HHCC肝癌细胞的细胞免疫分析，实现对这些癌细胞的灵敏检测，配合流式细胞技术进行癌细胞早期诊断。采用细胞融合技术制备了一对能同特异蛋白质上两种不同位点进行识别的高亲合力的单克隆抗体。实现了对金黄色葡萄球菌肠毒素C1及胱抑素C高灵敏和高特异性免疫分析。具体研究内容和结果如下：
(1) 通过三步水解法制备了氨基化的荧光化学发光双功能介孔二氧化硅纳米粒子。纳米通道内的疏水基团能有效的防止染料的泄漏。表面的氨基使该纳米粒子更易于生物功能化。由于纳米二氧化硅中独立的纳米通道能削弱荧光染料分子间的内滤效应能，从而有效地减弱荧光分子的猝灭。得到了90 nm的二氧化硅粒子的量子产率约为61%。相比核壳荧光纳米颗粒，化学发光试剂可以自由进入纳米粒子与荧光染料反应产生化学发光。结果表明，FCMSN是荧光标记和化学发光标记。在生物学中的应用，过碘酸钠氧化法被证明优于戊二醛法。表面氨基的量影响FCMSN在生物应用中的特异性。
(2) 建立了一种采用抗CD155和抗CD112单克隆抗体标记的荧光共振能量转移介孔二氧化硅纳米颗粒（FCMSN）检测肝癌细胞的方法。罗丹明6G与荧光素被同时掺杂到介孔二氧化硅纳米粒子中。得到的纳米颗粒的直径为90 nm。量子产率为69%。由于荧光素的发射光谱与罗丹明6G的激发峰高度重叠，且在纳米粒子中两种染料足够接近，所以两种染料之间会发生荧光共振能量转移。纳米孔道和二氧化硅网络骨架能有效削弱染料的内滤效应，也使激发峰更宽，增加染料的有效载荷量。更宽的斯托克位移减弱了激发光的干扰，同时提高检测的灵敏度。单克隆抗体的共价固定化采用不使用交联剂的过碘酸钠氧化法。这些优点使得检测SMMC-7721肝癌细胞HHCC细胞的纳米传感器具有较高的灵敏度和特异性。
(3) 通过将抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）单克隆抗体抗体共价修饰到核壳型二氧化硅纳米粒子上制备了一种敏感的和有选择性的检测结肠癌细胞的纳米传感器。透射电子显微镜（TEM）图像表明，纳米粒子和生物功能化的纳米粒子具有良好的分散性。过碘酸钠氧化的方法很好地保持了活性的抗体。荧光显微成像和流式细胞仪（FCM）的实验表明，纳米传感器能明显提高信号强度和区分三种靶细胞（Colo205，SW480和NCM460）。核膜双染色表明纳米传感器在细胞膜表面结合。最后，一个简单体系的示例证明抗EpCAM抗体纳米传感器能有效地区分Colo205细胞，并为后续研究打下了良好的基础。
(4) 建立了敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C1（SEC1）免疫分析。氨基化的染料掺杂的介孔二氧化硅纳米颗粒（FCMSN）作为标记物。由于染料和疏水基团之间的疏水相互作用，染料被有效固定在FCMSN的矩阵中。在FCMSN表面的胺基团提高了纳米颗粒的标记性质。使用双抗体夹心法，单克隆抗体（G8）和单克隆抗体（C4）分别作为捕获抗体和检测抗体。TCPO体系用来进行化学发光检测。激光诱导荧光则用来进行荧光检测。结果表明，FCMSN能够起到有效放大信号的作用。化学发光检测线性范围为0.025–2 ng/mL，检出限0.019 ng/ml（3σ）。工作曲线的回归方程为I = 3027.5 [SEC1]（ng/mL）+ 1804.6（R2 = 0.9958）。11次平行测量1 ng/ml SEC的相对标准偏差（R.S.D.）为4.6%。激光诱导荧光的线性范围0.05-2 ng/mL，检出限0.042 ng/mL，回归方程I = 302.5[SEC1] (ng/mL) + 672.6 (R2 = 0.9908)。测定1ng/mL SEC1（N = 11）的相对标准偏差（R.S.D.）为5.3%。此外，全自动化学发光分析仪能有效提高提高检测效率。为SEC1提供了敏感、快速、简便的检测方法。
(5) 胱抑素C是人体内一个重要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在肾损伤检测中，它是新的检测肾小球滤过率的标志物。在这章中，利用功能化的FCMSN作为标记物，采用染料溶出化学发光夹心免疫分析法对胱抑素C进行了检测。该法具有检出限低，简单快速的特点。氨基官能化的染料封装FCMSN采用三步水解法制备。纳米基质具内的疏水性环境用于固定染料。纳米粒子表面的氨基基团可以用于生物标记。此外，过碘酸钠标记法很好地保持了抗体活性。分析表明，该法线性范围0.0025–0.5 ng/mL (R2 = 0.9936)，检出限0.0020 ng/mL。11次平行测定0.25 ng/mL CysC的相对标准偏差（R.S.D.）为4.2%。