题目：猪卵母细胞体外成熟培养及孤雌胚胎体外培养的研究

摘 要

猪是人类最主要的肉用家畜，全世界猪肉的产量占肉类总产量的40%以上。我国是世界第一养猪大国，生猪的饲养量超过了全世界总饲养量的一半，养猪业在农业和整个国民经济中都占有十分重要的地位。此外，它在生理和解剖方面接近于人类，可以作为人类器官移植的理想供体来源。体外受精、核移植、器官移植等胚胎工程技术的研究和应用越来越广泛，卵母细胞体外培育的质量是决定胚胎生物工程研究和应用成败的关键因素之一，但至今卵母细胞体外培养的成熟效果仍然很不稳定。孤雌激活能够为探究胚胎早期发育机理、分析发育过程中相关基因功能等提供良好的实验材料。目前对猪卵母细胞孤雌激活方法和相关激活参数的研究已经比较成熟，但在激活后孤雌胚的体外培养仍然存在着一些难以攻克的难关，例如如何打破四细胞期的发育阻滞，如何提高其发育到囊胚的成功率、降低卵裂的畸形率等，这些都是亟待解决的问题。本研究对影响猪卵母细胞体外成熟效果及孤雌胚胎体外发育的因素进行研究，以期为猪卵母细胞体外成熟及胚胎体外发育相关机制研究提供参考依据，该研究对胚胎工程及人类器官移植的发展具有重要的现实意义。本试验通过对猪卵母细胞体外成熟培养和孤雌激活后的胚胎在体外培养过程中进行不同的处理，优化猪卵母细胞及胚胎体外培养的方式，并采用实时荧光定量PCR对猪卵母细胞在不同环境生长发育过程中关键基因的表达特征进行了系列检测，具体研究结果如下：

1、成熟培养基中添加六个不同浓度的表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）（0 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml），成熟培养44 h后，统计第一极体排出率（第一极体的释放是其成熟与否的标志），经孤雌激活后继续进行体外培养，统计孤雌胚的卵裂率和囊胚率。结果显示：向卵母细胞体外成熟（in vitro maturation, IVM）培养液中添加EGF的浓度为10 ng/ml时，EGF对促进猪卵母细胞第一极体的排出以及孤雌胚胎的卵裂发育效果最佳，当EGF的浓度高于10 ng/ml时，卵子的成熟效果和胚胎的卵裂生长情况变化差异均不显著（P>0.05），当EGF高达40 ng/ml时表现为和不添加EGF（0 ng/ml）的对照组间没有显著性差异（P>0.05）。

2、选择四个不同的白血病抑制因子（Leukemia inhibit factor，LIF）浓度（0 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml），将试验分三个组：IVM组（仅向体外成熟培养基IVM液中添加不同浓度的LIF）、IVC组（仅向胚胎培养基IVC液中添加不同浓度的LIF）、IVM-IVC组（成熟培养基和胚胎培养基中均添加相应不同浓度的LIF），经过体外成熟培养和孤雌激活后，统计成熟率、卵裂率和囊胚率，结果显示：添加0.5 ng/ml的LIF对提升猪卵母细胞孤雌电激活后胚胎的发育是最具促进作用的。

3、卵母细胞在体外培养不同时间（18 h，24 h，38 h，44 h）后去除其卵丘细胞，统计猪卵母细胞成熟率及孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。结果显示：除去卵丘细胞的时间对体外培养猪卵母细胞的第一极体排出率没有显著影响（P>0.05），共培组（是指脱卵丘细胞后，卵母细胞和脱下的卵丘细胞共培养）在培养18 h后脱卵丘细胞能显著促进胚胎的卵裂和囊胚形成，24 h、38 h、44 h后脱卵丘细胞，这三个组的卵裂率和囊胚率均低于18 h组，但三组之间的差异不显著（P>0.05）；独培组（是指脱卵丘细胞后，卵母细胞与卵丘细胞分开单独培养）在培养18 h后脱卵丘细胞，虽然与44 h组相比卵裂率没有明显提高，但其囊胚的形成率却有显著提高（P<0.05），24 h和38 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率均显著低于18 h和44 h组（P<0.05）。说明18 h可能是猪卵母细胞在体外培养过程中的一个重要节点，在此时破坏卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte-complexes ，COCs）的结构，推测可能是通过切断卵丘卵母细胞间的细胞通讯而给予卵丘卵母细胞间的细胞连接一个刺激信号，从而影响了卵母细胞中一些关键基因的表达，促进了核质成熟同步化。同时共培组的卵裂率和囊胚率均高于独培组，说明卵丘细胞的代谢产物对卵母细胞的发育成熟有一定促进作用。

4、利用实时荧光定量PCR技术检测经过不同浓度LIF处理后的成熟猪卵母细胞中GLUT1、CDX2、HSP70和ploy A四个基因的表达变化；以及在卵母细胞和孤雌胚胎不同成长时段这四个基因的表达规律。结果显示：

(1) 猪的成熟卵母细胞中GLUT1基因在LIF浓度为0 ng/ml和1 ng/ml时的表达量显著高于0.5 ng/ml组(P<0.05)；HSP70、CDX2和ploy A三个基因均为在LIF浓度为0 ng/ml时的表达量最大，且其表达量随LIF浓度的增加而减小,说明成熟培养基中添加LIF对HSP70、CDX2和ploy A三个基因的表达有显著的抑制作用。

(2) GLUT1在卵母细胞培养0 h时的表达量最大显著高于其余所有发育时段的表达量(P < 0.05)，这说明随着卵母细胞的不断成熟和发育，其代谢模式可能发生了变化，使GLUT1的表达越来越弱； CDX2在培养7 d后胚胎发育到囊胚期时的表达量最强，显著高于在其它发育阶段的表达量（P < 0.05），说明CDX2基因在囊胚期即内细胞团和滋养层的分化过程中起着重要的调节和诱导作用。 HSP70和ploy A基因在卵母细胞培养到44 h时的表达量最高，显著高于其余时段的表达量（P < 0.05），这一结果说明当卵母细胞成熟后，第一极体的释放，可能启动了HSP70基因和ploy A的快速大量表达，这一发现对在分子水平上揭示卵母细胞成熟代谢和成熟机理意义重大。

上述结果表明，猪卵母细胞体外培养过程中EGF的最佳添加浓度为10 ng/ml；合理添加LIF能提高体外培养猪卵母细胞的成熟率和孤雌胚胎的囊胚率；在试验中发现和确定了卵母细胞体外成熟培养过程中的几个时间关键点，即培养后的18 h和44h，这为猪卵母细胞体外培养及相关研究提供了一个新的参考；通过对几种重要基因的研究，发现HSP70和ploy A基因在卵母细胞成熟后快速大量表达，推测原因为第一极体的释放，可能启动了HSP70和ploy A的高效表达，这一新发现对在分子水平上揭示卵母细胞的成熟代谢机理、探究卵母细胞成熟过程的分子调控机制意义重大，更为进一步了解卵子和胚胎生长发育的分子机制打下基础。